陈元元, 吴 岩, 刘晓光

(江苏大学 生命科学研究院， 江苏 镇江 212003)

乙偶姻的化学名为3-羟基-2-丁酮(CH3COCHOHCH3)，又名甲基乙酰甲醇，是一种广泛使用的化合物，同时也是多种微生物的次生代谢产物。易燃，易挥发，易溶于水、混溶于乙醇，微溶于醚、石油醚。它具有令人愉悦的奶油香味，可用于奶油、乳品、酸奶和草莓型等香料的生产[1-3]。乙偶姻作为一种重要的平台化合物，广泛应用于食品、医药、化工、生物燃料等行业。目前实验室制备乙偶姻主要有从含乙偶姻的植物中提取以及微生物法和化学合成法。其中微生物法因原料可再生、反应条件温和而备受关注。

1 微生物乙偶姻的合成及分解代谢

在自然界中，许多微生物在糖酵解过程中能够将糖类转化为乙偶姻来避免酸中毒[4-5]。乙偶姻的产生伴随着副产物2, 3-丁二醇、2, 3-丁二酮、乙酸、乳酸等有机酸。乙偶姻在丁二醇脱氢酶作用下可逆地转换成2, 3-丁二醇或在丁二酮还原酶作用下可逆转换成2, 3-丁二酮。

1.1 微生物乙偶姻的合成代谢

在自然界中有许多微生物能够合成乙偶姻和2, 3-丁二醇，研究较多的主要包括克雷伯氏菌属(Klebisella)、肠杆菌属(Enterobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、沙雷氏菌属(Serratia)以及气单胞菌属(Aeromonas)等[6-9]。研究发现，微生物合成乙偶姻途径需要经历两个酶的催化，分别为α-乙酰乳酸合成酶和α-乙酰乳酸脱羧酶。糖类物质经糖酵解途径合成丙酮酸，两分子丙酮酸在α-乙酰乳酸合成酶的作用下生成乙酰乳酸和二氧化碳，随后乙酰乳酸经α-乙酰乳酸脱羧酶脱羧作用合成乙偶姻[4, 10]。微生物合成乙偶姻的途径如图1所示。

图1 微生物合成乙偶姻的途径

1—糖酵解途径；2—丙酮酸脱氢酶系；3—α-乙酰乳酸合成酶；4—α-乙酰乳酸脱羧酶；5—2, 3-丁二醇脱氢酶；6—2, 3丁二酮还原酶。

乙偶姻合成基因以操纵子的形式存在。Pieter Moons[11]等人发现在普城沙雷氏菌(Serratiaplymuthica)RVH1中，其合成途径和调控基因由一LysR型调控因子budR、结构基因budA(编码α-乙酰乳酸合成酶)、budB(编码α-乙酰乳酸脱羧酶)和budC(编码2, 3-丁二醇脱氢酶)组成。budA和budB形成一个操纵子，和budR之间间隔382 bp。Renna[12]等人通过对Bacillussubtilis的研究发现乙偶姻合成和调控基因包括：alsS(编码α-乙酰乳酸合成酶)、alsD(编码α-乙酰乳酸脱羧酶)和alsR(编码LysR型调控子)。alsS和alsD属于一个操纵子，alsR与alsSD操纵子的转录方向相反。Vibriocholerae乙偶姻合成基因与Bacillussubtilis的相似[13]。粘滞沙雷氏菌(Serratiamarcescens)乙偶姻合成基因包括slaA(编码α-乙酰乳酸合成酶)、slaB(编码α-乙酰乳酸脱羧酶)和slaC(编码2, 3-丁二醇脱氢酶)。与Klebsiellasp,Klebsiellapneumonie,Vibriosp和Vibriocholerae不同，Serratiamarcescens的slaC与其他基因分隔开[14]。

1.2 微生物乙偶姻的分解代谢

乙偶姻是广泛应用于食品行业中的食用香料，在微生物发酵过程中伴随2, 3-丁二醇合成代谢过程中产生[15-17]。2, 3-丁二醇是一种重要的生物类化学品，广泛用于化工、食品、航空航天燃料等领域，可用来制备聚合物、油墨、香水、熏蒸剂、增湿剂、软化剂、增塑剂、药物手性载体等[18-19]。

在Clostridiummagnum，Klebsiellapneumoniae，Pectobacteriumcarotovorum，Pseudomonasputida，Bacillussubtilis，Pelobactercarbinolicus和Alcaligeneseutrophus细菌中，乙偶姻的分解代谢由羟基丁酮脱氢酶酶系(AoDH ES)催化完成，包括：焦磷酸硫胺素依赖型的羟基丁酮脱氢酶(AoDH E1)、二氢硫辛酰胺乙酰转移酶(AoDH E2)和二氢硫辛酰胺乙酰脱氢酶(AoDH E3)[20， 21]，AoDH ES的结构基因acoA、acoB、acoC线性依次排列于染色体上[21-25]，在P.carbinolicus，K.pneumoniae和C.magnum中的acoL基因也属于aco基因簇。而Huang等[26]通过研究则提出不同观点，他认为由acu基因簇编码枯草芽孢杆菌分解羟基丁酮的酶。

Klebsiellapneumoniae是一种广泛研究并应用于工业化产生2, 3-丁二醇的菌株。在K.pneumoniae的碳代谢过程中，有3种非常重要的酶控制2, 3-丁二醇的合成路径，乙酰乳酸脱羧酶，乙酰乳酸合成酶，2, 3-丁二醇脱氢酶分别为基因budA,budB和budC所编码。这3种酶在2, 3-丁二醇和细胞生长中的功能和作用机制已经研究出来了。很多研究都集中在这3种酶的合作机制和相互影响上。对K.pneumoniaeKCTC2242::ΔwabG菌株对这3种酶进行单突变，双突变，三突变，过表达的研究表明，过表达菌株2, 3-丁二醇产量增加。budBA过表达产量增加最多。budA基因编码的乙酰乳酸脱羧酶的支链氨基酸有利于细胞生长，budB基因编码的乙酰乳酸合成酶以一种氧气依赖的方式增强乙酰乳酸转换成乙偶姻，budC基因编码的2, 3-丁二醇脱氢酶催化乙偶姻和2, 3-丁二醇之间的可逆反应并调控细胞内NAD+/NADH的平衡[27]。

2 乙偶姻合成与分解代谢的调控

2.1 乙偶姻合成调控

在普城沙雷氏菌(Serratiaplymuthica)RVH1和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumonia)中，budR编码LysR型调控因子，此调控子能够激活budAB结构操纵子，而budR自身负调控。另外一些外部刺激物如群体感应信号分子和醋酸盐正调控budR。群体感应信号分子和醋酸盐正调控对budR转录的诱导不需要budR，表明在环境信号分子对budR启动子的作用中还涉及到其他的调控子[11]。

在Serratiamarcescens合成乙偶姻的过程中， LuxR型的调控因子SwrR和LysR型调控因子SlaR调控slaA和slaB的转录但不影响slaC的表达。通过过表达alsSD操纵子增加α-乙酰乳酸合成酶量能够提高乙偶姻产量；另外，通过敲除bdhA、acoA、pta阻断乙偶姻降解以及竞争合成路径能够提高乙偶姻产量[8]。

Renna[12]对Bacillussubtilis乙偶姻合成基因调控研究发现，若alsR基因突变，alsSD操纵子则不能表达。alsS和alsR转录融合分析表明alsSD操纵子的转录需要AlsR参与，AlsR在稳定期表达量增加。此外，pH值的下降也可能是激活alsS转录的一个条件[1]。Andrew[1]等人研究发现CcpA蛋白能调控枯草芽孢杆菌乙偶姻合成基因的表达。CcpA是一些结合于靶基因启动子区域的保守cre位点LacI/GalR家族的转录调控蛋白。在部分调节葡萄糖代谢的Hpr/Crh信号通路中CcpA作为抑制子阻止细胞利用第二碳源。另外当枯草芽孢杆菌生长于葡萄糖培养基时激活碳分泌路径包括乙偶姻分泌途径需要CcpA。但是alsSD操纵子没有cre位点，另外醋酸盐也能够增加alsSD的转录，表明CcpA对alsSD的影响是间接的。CcpA调控渠道可能是依赖于ack/pta路径积累的醋酸盐来调控alsSD的表达。

Kovacikova等人[13]研究发现在Vibriocholerae中，在群体密度比较低时，群体感应调控激活子AphA抑制乙偶姻合成基因表达，可达15倍。普里斯考尔实验(Voges Proskauer test, V-P实验)表明，在非诱导表达的条件下，删除AphA能够提高乙偶姻的产量。LysR型调控因子AlsR也是乙偶姻合成所必需的。

2.2 乙偶姻分解代谢的调控

在葡萄糖缺乏的情况下BacilluslicheniformisDSM13的acoABCL和acuABC操纵子在转录水平的诱导增强。引物延伸分析表明acoABCL操纵子受σL依赖型的启动子控制，acuABC操纵子受σA依赖型的启动子控制。当碳源葡萄糖枯竭时葡萄糖抑制acoA启动子的转录而乙偶姻诱导其转录。acuA启动子具有相似的诱导模式但是它的活性不依赖于乙偶姻的存在。这些表明acoABCL操纵子主要负责B.licheniformis中乙偶姻和2, 3-丁二醇的降解[28]。

Bacillussubtilis中存在丁二醇循环。醋酸是这个循环反应的终产物，丙酮转换成两分子的醋酸，外界条件对这个功能循环的酶的合成有很大影响。乙偶姻刺激乙偶姻脱氢酶和二乙酰甲基甲醇合酶合成。葡萄糖通过阻遏酶的分解代谢物来对抗这种影响。二乙酰甲基甲醇合酶，丁二醇脱氢酶和二乙酰还原酶与以上两种分解代谢物诱导的酶形成对比。乙偶姻没有任何调控效应。从乙偶姻生成二乙酰的反应是由一种酶—乙偶姻脱氢酶完成的，葡萄糖诱导二乙酰还原酶并阻遏乙偶姻脱氢酶，乙偶姻诱导乙偶姻脱氢酶的合成但并不影响二乙酰还原酶[29]。

由于乙偶姻是许多微生物分泌一种重要的生理代谢分泌物，乙偶姻的分泌，能够通过V-P实验检测出并可作为一种微生物分类标志，对微生物有着重要的生理意义，主要包括避免酸中毒，参与调解NAD+/NADH的比率，储存碳源。乙偶姻合成代谢涉及α-乙酰乳酸合成酶，α-乙酰乳酸脱羧酶。尽管这些比较受关注而且已经做了很多研究了，然而乙偶姻代谢机制还包含不同的观点，Current发现分解代谢物控制蛋白A(CcpA)调节的碳降解物阻遏可能提供一个合理的细菌中的控制机制[30]。到目前为止，这是细菌中的乙偶姻机制的第一个整合观点，尤其是降解方面。细菌中乙偶姻的异化有利于提供一个更好的对微生物争夺资源的策略，从而能更好的利用这些微生物。

3 乙偶姻代谢的生理意义

3.1 维持pH值稳定

细菌将丙酮酸转化为乙偶姻或2, 3-丁二醇，可以避免丙酮酸和乙酸等酸性产物在胞内的过量积累[31-32]，从而维持pH值的稳定，也避免了菌体的过早衰亡。

3.2 作为贮存碳源

当葡萄糖等碳源物质利用完之后，乙偶姻可以作为替代的能源或碳源[33]，所以在细菌体内乙偶姻和2, 3-丁二醇可作为贮存碳源[34-35]。

3.3 维持NAD+/NADH的平衡

乙偶姻和2, 3-丁二醇之间的相互转化是和NAD+与NADH之间的转化相偶联的，因此乙偶姻/2, 3-丁二醇代谢途径也作为维持细菌体内NAD+/NADH平衡的策略[35-36]。

4 乙偶姻的应用及市场前景

4.1 植物保护方面的应用

乙偶姻广泛存在于许多植物中，如玉米、可可、葡萄、拟南芥、菊芋等。乙偶姻对这些植物的正常生长有着非常重要的作用。近些年研究表明乙偶姻具有诱导系统抗性，促进植物生长的作用，在植物保护方面有着重要作用。

Cho[37]等人发现在拟南芥中，植物根际促生菌PseudomonaschlororaphisO6诱导拟南芥对其他生物和外界环境压力的耐受性。耐旱性与根际促生菌P.chlororaphisO6寄生的拟南芥关闭气孔减少水分蒸发有关，并受气孔孔径以及气孔关闭的百分比调控。气孔关闭及耐旱性受乙偶姻调节。乙偶姻是P.chlororaphisO6的挥发性代谢产物通过对拟南芥突变株的研究表明对干旱的耐受性需要水杨酸，乙烯以及茉莉酸的信号通路，同时诱导耐旱性和气孔关闭依赖于脱落酸受体-1和气孔开放因子-1，水杨酸信号诱导耐旱性。研究表明细菌产生的乙偶姻通过水杨酸依赖性的机制诱导拟南芥耐旱性。

植物根际促生菌赋予植物免疫力使植物能够对抗一些叶病， 根际促生菌通过激活植物防御系统来减少植物对病原菌侵袭的易感性。在拟南芥中，乙偶姻诱导系统抗性(ISR)保护植物抵御疾病。把拟南芥(Col-0)置于枯草芽孢杆菌FBI7中，结果发现，与没用FBI7处理的对照组相比发现实验组拟南芥感染Pseudomonassyringaetomato DC3000的严重程度明显减弱。枯草芽孢杆菌外源性应用产生出诱导子乙偶姻，乙偶姻引发植物系统抗性并保护植物抵御DC3000病原菌。此外，枯草芽孢杆菌乙偶姻合成突变株乙偶姻合成减少导致拟南芥抵御病原菌侵染的能力减弱。通过对FBI7和拟南芥防御缺失突变株的进一步分析表明DC3000耐受性通过NPRI路径发生并需要水杨酸(SA)/乙烯(ET)而不需要茉莉酸(JA)[38-39]。

植物根际促生菌产生乙偶姻还有增加植物产量的作用，通过对辣椒苗的研究表明细菌内生菌对辣椒苗有促进生长和抵御病原菌的作用，其中Pseudomonasrhodesiae和Pantoeaananatis对辣椒苗的促生作用最明显。另外，乙偶姻是调节根际促生菌和植物之间相互关系的信号分子[40]。另外研究发现乙偶姻也能促进拟南芥生长[41]。

4.2 在医药、化工行业的应用

乙偶姻是美国能源部优先开发的平台化合物，广泛应用于医药、化工等领域。如图2所示，乙偶姻与光气反应生成4-氯-4, 5-二甲基-1, 3二氧杂环戊烷-2-酮(CDMDO)。

图2 CDMDO的合成

CDMDO是一种重要的医药中间体，主要用于许多药物的修饰来合成具有光学活性的手性药物, 从而较大程度地提高药效, 降低药物副作用。如作为合成心血管药物奥美沙坦，青霉素类药物仑氨西林，氟喹诺酮类抗菌药普卢利沙星等药物的中间体[25]。

此外，乙偶姻的下游产物2, 3-丁二醇是一种重要的的化工原料和液体燃料。2, 3-丁二醇可以作为一种潜在的平台化合物替代传统的碳四烃。用于大规模的合成甲乙酮(优良溶剂)和1，3-丁二烯(广泛应用于合成橡胶、聚酯和聚亚胺酯等领域)。2，3-丁二醇还可用于制备油墨、香水、熏蒸剂、增湿剂、软化剂、增塑剂、炸药、增加燃料辛烷值及药物手性载体等。

以乙偶姻为起始原料，经过酰氯化、成环、脱氯化氢、溴化合成4-溴甲基-5-甲基-1, 3-二氧戊环-2-酮，再和氨苄青霉素反应合成伦氨苄西林盐酸盐。伦氨苄西林盐酸盐是半合成青霉素、氨苄青霉素的前体药物。伦氨苄西林盐酸盐属半合成青霉素类广谱抗生素，它通过在肠壁中水解成氨苄西林而发挥抗菌作用。其抗菌作用机制与青霉素相同，主要通过与细菌主要青霉素结合蛋白(PBPs)结合，干扰细菌细胞壁的合成而起杀菌作用。具有可口服，吸收快，稳定性好，浓度高，比氨苄青霉素作用强，毒副作用低的优点。对革兰氏阳性菌如金葡菌、链球菌、肺炎球菌、肠球菌等和革兰氏阴性菌，如大肠杆菌、奇异变形杆菌、流感杆菌等均有较好疗效。 临床上用于敏感菌所致染呼吸道感染、单纯性膀胱炎、皮肤及软组织感染，以及其他感染。

乙偶姻是一种手性化合物，手性纯乙偶姻可用于合成一种新的有光学活性的α-羟基酮类衍生物，还能合成液晶材料，如手性的近晶材料和向列材料[42]。此外乙偶姻还应用于生产生物柴油，生物柴油又称脂肪酸甲酯，是一种为了应对日益短缺的能源而研究开发出来的新型能源。生物柴油的研究越来越受到重视。生物柴油能够转化餐饮废油，防止地沟油重新回到餐桌。生物柴油与传统石化柴油相比具有环保，闪点高安全，十六烷值高从而提高发动机寿命以及有良好的润滑性能的优点。生物柴油的制备方法有很多种，包括：酸催化法、碱催化法、脂肪酶或生物酶法和超临界萃取法。以糖类为原料生成乙偶姻，乙偶姻再转化为2, 3-丁二醇，2, 3-丁二醇再经过偶联工艺生成生物柴油。目前在很多国家生物柴油已经实现了产业化。

4.3 在食品、酒、烟草行业的应用

随着生活水平的日益提高，人们对食品的要求日益提高，越来越多的食用香料被广泛应用到食品行业中。目前已知的天然香料有3000多种，而合成香料则多达7000多种。其中乙偶姻作为一种具有令人愉悦的奶香味的物质而被广泛应用。中国GB2760-86规定乙偶姻为允许使用的食用香料，主要用于配置奶香型、肉香型、草莓香型香精，也可用于奶制品中。

80%含量的乙偶姻俗称“醋嗡”是酒类调香中一个极其重要的品种。

另外，乙偶姻在烟草行业也有广泛应用。乙偶姻、1-戊烯-3-醇、1-戊醇等成分具有典型的香气特征，对烟草香气具有良好的影响，是特香型考烟品种中特殊香气风格的主要物质基础。

4.4 在化妆品行业的应用

乙偶姻还可以应用在化妆品行业中，现如今绝大多数的香料都是通过化学合成方法得到的。但是用化学法合成的香料存在很多问题，如会给人们的健康带来隐患，化学合成品纯度下降，常含消旋混合物，提取目的异构体或手性香料十分困难，而且人们对于合成的添加剂用于化妆品、食品越来越反感。乙偶姻被视为一种纯天然的香料在化妆品行业的应用会越来越多，具有很好的应用前景。

近年来乙偶姻的需求量不断地增加。目前乙偶姻的生产方法主要是化学合成法比如以2, 3-丁二酮为原料加氢还原合成，以2, 3-丁二醇为原料选择性氧化合成。另外，微生物发酵法产生乙偶姻也是工业化生产乙偶姻的一种重要方法，微生物法因原料可再生，发酵条件温和自然界中能积累高浓度乙偶姻的菌种主要包括Bacillussubtilis、Klebsiellapneumondiae、和Hanseniasporaguillieromondii。目前国外微生物发酵法生产乙偶姻已经产业化。国内的一些生物公司如爱普香料集团股份有限公司也实现了乙偶姻产业化。生物发酵法符合可持续发展的要求，有很好的发展前景。

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