林 函，高雅静，徐 敏，梅虹霞，李晓珩，连庆泉

（温州医科大学附属第二医院麻醉科，浙江温州 325027）

全氟辛烷磺酸对大鼠神经干细胞增殖和迁移的影响

林 函*，高雅静*，徐 敏，梅虹霞，李晓珩，连庆泉

（温州医科大学附属第二医院麻醉科，浙江温州 325027）

目的探讨全氟辛烷磺酸（PFOS）对大鼠神经干细胞增殖和迁移的影响及其机制。方法分离怀孕15 d（E15）SD大鼠大脑皮质，神经上皮干细胞蛋白染色鉴定培养的神经干细胞。PFOS 10，50和100μm o l·L－1处理大鼠神经干细胞24 h后，Edu免疫荧光染色检测神经干细胞的增殖；荧光定量聚合酶链反应法（qPCR）检测样本中Stat3，Sox2和Notch1 mRNA表达；Western蛋白质印迹法检测Stat3及p-Stat3蛋白表达；采用Transwell小室检测神经干细胞的迁移能力。结果经鉴定分离培养的原代细胞为神经干细胞。Edu免疫荧光染色结果显示，与正常对照组相比，经PFOS处理的神经干细胞的Edu阳性率明显下降（P＜0．05），说明PFOS抑制神经干细胞的增殖；qPCR检测结果显示，PFOS处理组神经干细胞中Stat3 mRNA表达显著降低（P＜0．05）；Western蛋白质印迹实验结果表明，PFOS组p-Stat3蛋白的表达降低（P＜0．05），但总Stat3蛋白表达无变化；Transwell小室检测结果显示，PFOS具有抑制神经干细胞迁移的能力（P＜0．05）。结论PFOS可导致神经干细胞增殖和迁移能力降低，可能与抑制Stat3的转录和翻译后的磷酸化过程有关。

全氟辛烷磺酸；神经干细胞；增殖；迁移；Stat3

DO l：10．3867／j．issn．1000-3002．2014．01．003

全氟辛烷磺酸（perfluorooctane sulfonate，PFOS）是人工合成的氟表面活性剂，由于其磺酰基或羧基端的无极性，而胎儿／新生儿的血脑屏障发育不成熟，导致PFOS可以进入发育中的大脑［1－2］。新生大鼠给予高剂量的PFOS引起神经系统发育延迟甚至死亡［3－4］。细胞实验发现，PFOS明显减少小胶质细胞（小鼠N9细胞株）的活性、破坏线粒体膜完整性、影响凋亡调节基因的表达［5］。研究表明，PFOS对神经干细胞自然分化的过程的影响主要表现为抑制神经干细胞向神经元方向分化，并且PFOS的这种作用是通过过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptorγ，PPARγ）调节的［6］。

Stat3蛋白是一种潜在的细胞质转录因子，在将信息从膜传递到核中起着主要的作用，受细胞因子，生长因子及干扰素类的激活［7］，它不仅在胚胎干细胞更新以及多能干细胞表型维持当中起着关键性的决定作用［8－9］，而且还对细胞生长发育过程具有调节作用，包括细胞增殖、分化以及细胞凋亡［10－11］。Jak／Stat信号通路被激活后，前体祖细胞的增殖能力增强，并且Wnt通路还可以通过对Jak／Stat信号通路进行调节从而决定祖细胞的增殖能力［12］，另外LIF／gp130复合物也可以激活Jak／Stat信号通路引起细胞的生长加速［13］。有研究表明，白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）通过激活Stat3信号通路后，可以促进骨髓间充质干细胞的迁移和存活的能力［11］，Stat3还参与了调节白细胞、上皮细胞及角化细胞的迁移过程［13］。Rajan等［14］的研究发现，孕晚期（E14．5）的神经干细胞中的Stat3活动的增强将导致其向胶质细胞分化，然而，还有数据证实抑制Stat3将直接诱导其向神经元方向分化，从而抑制星形胶质细胞的形成［15］。

基于PFOS对胎儿及新生儿的敏感性，本研究选择孕15 d（E15）的胎大鼠大脑皮质神经干细胞，探讨PFOS对大脑神经干细胞增殖和迁移的影响及机制。

1 材料与方法

1．1 试剂和仪器

DMEM／F12和B27 supplement，美国Gibco公司；碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和表皮生长因子（epidermal grow th factor，EGF），美国Ca li-Bio公司；大鼠Stat3抗体、P-Stat3抗体及大鼠神经上皮干细胞蛋白抗体，美国Abcam公司；Trizol和EDU试剂盒，美国Invitrogen公司；荧光定量PCR仪和SsoFast EvaGreen Supermix，美国Bio-Rad公司；逆转录试剂盒，美国Promega公司；Western蛋白质印迹法鼠抗兔二抗，碧云天公司；Transwell板，美国Corning公司。CO2培养箱，美国Thermo公司；解剖显微镜，日本Olympus；荧光显微镜，日本Nikon公司。

1．2 细胞制备及鉴定

雌雄SD大鼠，体质量250～350 g，温州医科大学实验动物中心提供，动物许可证编号：SCXK（浙）2010-0044。将雌雄SD大鼠放在定制的铁笼里进行交配，室温为21．5～22．5℃，自然照明，12 h昼夜交替饲养，以查获阴拴日为孕第0天，记为E0。分离E15大鼠的皮质神经干细胞，在含有神经营养因子（2%B27，bFGF 20μg·L－1以及EGF 20μg·L－1）的DMED／F12的培养基中进行培养，放在含5%CO2、充分湿化的37℃的细胞培养箱中孵育培养。培养3～4 d进行细胞传代，稳定传至第3代时，再将原代和培养到第3代（P3）的神经干细胞接种到6孔板中的盖玻片上，加入少量培养基在培养箱内继续培养，4 h后取出培养板，进行神经上皮干细胞蛋白免疫细胞化学染色鉴定，荧光显微镜拍照。

1．3 细胞分组处理

PFOS在人类中的半衰期一般为4～6年［16］，PFOS生产工厂的工人血清中PFOS的的一般水平为0．5～2 m g·L－1，报道最高者达到13 mg·L－1（26μm o l·L－1）［1］。由于本研究设计作用的时间短暂（24 h），故选择高于人血清水平的PFOS（10，50和100μmo l·L－1），文献报道也有选择此浓度PFOS进行体外神经毒性研究［17］。

取鉴定的细胞，调节细胞密度至2×106L－1，接种至6孔板，随机分为5组：正常对照组、终浓度为0．1% DMSO组、PFOS终浓度为10，50和100μmol·L－1组。

1．4 Edu荧光染色检测细胞增殖

取1．3分组的细胞，放入培养箱孵育12 h后进行24 h药物处理（细胞继续培养20 h后，加入终浓度为10μmo l·L－1的Edu，继续培养4 h）。按照说明书进行Edu与细胞核（Hoechst33342）的染色后，荧光显微镜下拍照，每组按照上下左右中间的位置随机选取5个视野，分别计数Edu阳性细胞平均数及总细胞数（细胞核的总数），最后用Edu细胞的阳性率表示神经干细胞的增殖。

1．5 qPCR检测神经干细胞的m RNA水平的改变

取1．3分组的细胞，孵育12 h进行药物干预24 h后，按Trizo l试剂说明书提取各组神经干细胞的总RNA，并对总RNA的浓度与吸光度值进行测定，将RNA逆转为cDNA，采用标准曲线法将产物cDNA进行qPCR。其引物序列如下，β肌动蛋白：上游引物（F）CCCATCTATGAGGGTTACGC；下游引物（R）TTTAATGTCACGCACGATTTC；Stat3：（F）TACCAGCAAAATCAGGTTGCT；（R）ACATCCCCAGAGTCCTTATCAA；Sox2：（F）TACCTCTTCCTCCCACTCCAG；（R）AATCTCTCCCCTTCTCCAGTTC；Notch1：（F）ACATCCCCAGAGTCCTTATCAA；（R）GAAAAGCCACCGAGATAGTCAG。采用相对稀释标准曲线法测定目的基因Stat3，Sox2和Notch1 mRNA的相对表达水平。

1．6 Western蛋白质印迹法检测神经干细胞蛋白表达

取1．3分组的细胞，孵育12 h进行药物干预24 h后，收集细胞进行离心沉淀，加入适量的裂解液和磷酸酶抑制剂。置于冰上静止30 m in，收集在EP管内超声（100～200 w）5 s，3次。用冷冻离心机以12 000×g的速度离心10 m in，收取上清液，用BCA工作试剂盒测定蛋白浓度，每条泳道蛋白上样量20μg，电泳、转膜后用5%脱脂奶粉封闭2 h，加入兔抗大鼠β肌动蛋白和p-Stat3一抗，分别按1∶2000和1∶1000的滴度稀释，4℃过夜。TBST洗膜，加入稀释比例为1∶5000的鼠抗兔二抗，室温孵育2 h，TBST充分洗膜，通过曝光后显示条带。将p-Stat3条带用一抗二抗去除液洗涤20 m in后，加入兔抗大鼠Stat3一抗，按1∶1000的滴度稀释，4℃过夜。TBST洗膜，加入稀释比例为1∶5000的二抗，室温孵育2 h，TBST充分洗膜，通过曝光后显示条带。用Quantity One 4．62软件分析目标蛋白条带和内参蛋白条带的积分吸光度（integrated absorbance，IA），以两者IA的比值表示目标蛋白的相对表达水平。

1．7 Transwell检测神经干细胞的迁移能力

收集1．3项处理的细胞，用含有0．1%BSA的培养基重悬细胞，按照5×108的密度接种100μL到Transwell板的上室中，下室中加入600μL含有10%胎牛血清（FBS）的培养基，放入培养箱中继续培养24 h［18］。培养好后取出Transwell板，将上室培养基吸净，再将小室放入甲醇中室温固定15～20 m in，PBS清洗1次后结晶紫染色15～20 m in，PBS清洗直至不再有颜色。用棉签擦拭上室中的细胞，显微镜下观察下室细胞，记数，每组按照上下左右中的位置随机选取5个视野，取5个视野细胞总数的均数进行统计分析，以迁移至下室细胞个数的均数表示细胞的迁移能力。

1．8 统计学分析

2 结果

2．1 神经干细胞的鉴定

图1结果显示，刚接种的细胞折光性好，呈球形，培养3～4 d逐渐增殖为多细胞组成的神经球（图1A），培养至第3代的神经球经过巢蛋白（nestin）免疫荧光染色特异性标记后呈现绿色的荧光（图1B），DAPI标记神经干细胞的细胞核，免疫荧光呈现蓝色（图1C）。免疫荧光的结果显示，巢蛋白特异性标记的神经干细胞在DAPI标记神经干细胞的细胞核中阳性率＞95%，证明培养至第3代的细胞仍为纯度很高的神经干细胞。

Fig．1 ldentification of neural stem cells by nestin immunofluorescence staining．The neural stem cells of the third generation with nestin immunofluorescence staining were clustered into neural spheres（A）．The cells of the neural spheres were nearly nestin positive（B）．The cell nuclei were stained with DAPI（C）．

2．2 全氟辛烷磺酸对神经干细胞增殖的影响

如表1和图2所示，与正常对照组相比，PFOS 10μmol·L－1组神经干细胞Edu阳性率统计学无明显差异，说明此浓度对神经干细胞的增殖无抑制作用，PFOS 50和100μmol·L－1组神经干细胞Edu阳性率显著下降，说明PFOS对神经干细胞的增殖有明显抑制作用（P＜0．01）。

Tab．1 Effect of perfluorooctane sulfonate（PFOS）on proliferation of neural stem cells

Fig．2 Effect of PFOS on proliferation of neural stem cells by Edu immunofluorescence staining（green）and DAPl immunofluorescence staining（×200）．See Tab．1 for the cell treatment．A：normal control group；B：0．1%DMSO group；C－E：PFOS 10，50 and 100μmol·L－1group，respectively．

2．3 全氟辛烷磺酸对神经干细胞基因表达的影响

表2结果显示，与正常对照组相比，经PFOS处理后的神经干细胞Stat3基因的表达显著下降（P＜0．05），Sox2和Notch1基因的表达无明显差异。

Tab．2 Effect of PFOS on mRNA expression of Stat3，Sox2 and Notch1 by qPCR

2．4 全氟辛烷磺酸对神经干细胞p-Stat3和Stat3蛋白表达的影响

Western蛋白质印迹检测结果显示（表3和图3），与对正常照组相比，PFOS处理组p-Stat3蛋白相对表达均显著降低，且差异具有显著意义（P＜0．05），但Stat3蛋白表达无改变。

Tab．3 Effect of PFOS on p-Stat3 and Stat3 protein expression

Fig．3 Effect of PFOS on p-Stat3 and Stat3 expressions by Wes tern blotting．See Tab．1 for the cell treatment．Lane 1：normal control；lane 2：0．1%DMSO；lane 3－5：PFOS 10，50 and 100μmol·L－1group for 24 h，respectively．

2．5 全氟辛烷磺酸对神经干细胞迁移的影响

Transwell结果显示（表4和图4），与正常对照组相比，PFOS处理组的神经干细胞迁移数量均显著降低（P＜0．01），并随着PFOS浓度增加，迁移率有逐渐降低的趋势。

Tab．4 Effect of PFOS on migration of neural stem cells

Fig．4 Effect of PFOS on migration of neural stem cells by Transwell（20×10）．See Tab．1 for the cell treatment．A：normal control B：0．1%DMSO；C－E：PFOS 10，50 and 100μmol·L－1group，respectively．

3 讨论

本研究结果发现，PFOS处理使Stat3 mRNA水平有所下降，p-Stat3蛋白表达下降，但总Stat3的蛋白表达无改变；Transwell检测的结果显示，神经干细胞的迁移被抑制。Stat3 m RNA水平下降，但总Stat3蛋白水平不变的原因尚待进一步研究。总Stat3的蛋白表达水平不变，p-Stat3蛋白下降，说明PFOS改变了翻译后磷酸化过程，PFOS对神经干细胞增殖和迁移的抑制作用可能是通过分别抑制Stat3的转录过程和Stat3翻译后的磷酸化过程，从而改变Stat3基因在神经干细胞发育过程中的作用。有研究发现，PPARγ受体对神经干细胞的增殖过程有影响［19］，并且Cimini等［20］提出了PPARγ受体还对神经干细胞的迁移过程也具有某些影响作用，但是其具体机制仍还不清楚。通常情况下，PPARγ受体可以分为Stat3，Wnt及NFkB等信号通路，PPARγ受体可以通过Stat3通路和Wnt通路对stat3产生影响。PFOS对神经干细胞的Stat3影响是否通过PPARγ受体介导，需要进一步研究，但从本研究结果看，至少PFOS所致的Stat3翻译后磷酸化的改变不可能由PPARγ受体介导。Sox基因家族是由众多具有HMG box保守序列的基因构成的超基因家族，其编码的蛋白质具有结合DNA的能力，在维持神经干细胞的未分化状态的过程中起着非常关键的作用［21］。事实上，Sox蛋白与DNA序列结合发挥作用主要取决于与其他转录因子的协同结合，也可以通过靶控基因和亚基起作用，而且Sox2蛋白表达与细胞环境有关，在不同细胞环境下，Sox2表现的作用将会有所不同。而本研究发现PFOS对神经干细胞Sox2 m RNA表达无影响，可能PFOS并没有作用于Sox2的调控基因或调控因子。Notch信号通路是受体和配体双分子间的相互作用，这个通路会对细胞发育的多种结果产生影响，其中包括细胞的增殖、分化、凋亡、迁移以及血管的再生等过程［22］。在某些情况下，Notch活化将促进神经干细胞自我再生［23］。而在另一些环境下，将会促使神经干细胞向星形胶质细胞方向分化［24－25］。本研究发现，Notch m RNA表达水平没有发生改变。因此，PFOS可能并不影响神经干细胞Notch基因与蛋白的表达。本研究尚存在一些不足，未观察PFOS对神经干细胞分化的影响，仅进行PFOS急性短时间暴毒研究，PFOS影响神经干细胞迁移作用的具体机制有待进一步验证。

本研究发现，PFOS对神经干细胞的增殖和迁移均产生影响，其机制可能为分别抑制Stat3的转录过程和Stat3翻译后的磷酸化过程。

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Effect of perfluorooctane sulfonate on proliferation and migration of neural stem cells of rats

LIN Han*，GAO Ya-jing*，XU Min，MEI Hong-xia，LI Xiao-heng，LIAN Qing-quan
（Department of Anesthesiology，the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325027，China）

OBJECTlVETo investigate the effect of perfluorooctane sulfonate（PFOS）on proliferation and migration of neural stem cells in rats，and explore the mechanism．METHODSNeural stem cells derived from the forebrain of rat E15 embryos were cultured in vitro．They were identified by neuroepithelial stem cell protein staining and treated with PFOS 10，50 and 100μmol·L－1for24 h．Cell proliferation was analyzed by Edu staining．The mRNA expression level of Stat3，Sox2 and Notch1 of the samples was detected by qPCR．The protein expression level of phosphorylated and total Stat3 was measured by Western b lotting．Cell migration ability of neural stem cells was tested by Transwell．RESULTSThe primary neural stem cells were identified as neural stem cells．Com pared with the control group，the positive rate of Edu staining of neural stem cells treated with PFOS was decreased，suggesting that PFOS was able to inhibit the proliferation of neural stem cells．The mRNA expression level of Stat3 re lated to appreciation and migration of neural stem cells was significantly reduced（P＜0．05）．Western blotting analysis revealed that PFOS inhibited the protein expression level of phosphorylated Stat3（P＜0．05）rather than that of total Stat3（P＞0．05）．In addition，PFOS also could inhibit the migration ability of neural stem cells．CONCLUSlONPFOS can inhibit the proliferation and migration ability of neural stem cells in vitro，possibly by affecting the transcription and phosphorylation of the posttranslation process of the Stat3 gene．

perfluorooctane sulfonate；neural stem cells；proliferation；migration；Stat3

LIAN Qin-quan，E-mail：lianqingquanmz＠163．com

R971

A

1000-3002（2014）01-0018-06

Foundation item：The project supported by Program of Zhejiang Provincial Medical and Health Platform（2012ZDA037）；Youth Talents Funding Program of Zhejiang Provincial Health Bureau of Traditional Chinese Medicine（2010ZQ011）；and Qianjiang Talents Program of Zhejiang Provincial Science and Technology Bureau（2012R10073）

2013-10-12 接受日期：2014-01-31）

（本文编辑：乔 虹）

浙江省医药卫生平台重点资助计划（2012ZDA037）；浙江省卫生厅中医药优秀青年人才基金计划（2010ZQ011）；浙江省科教厅钱江人才计划（2012R10073）

林 函，男，博士，主要从事麻醉药的神经毒理学研究；高雅静，女，硕士研究生，主要从事麻醉药的神经毒理学研究。

连庆泉，E-mail：lianqingquanmz＠163．com

*共同第一作者．

*Co-first authors．