王 雪，王希敏，刘可春，刘 新，韩利文，彭维兵，何秋霞，侯海荣

（山东省科学院生物研究所，山东济南 250014）

斑马鱼胚胎在肾毒性损伤研究中的应用进展

王 雪，王希敏，刘可春，刘 新，韩利文，彭维兵，何秋霞，侯海荣

（山东省科学院生物研究所，山东济南 250014）

肾是机体的主要排泄器官，极易受到体内外各种化合物的毒性影响而引起肾功能损害，预防和治疗中毒性肾损伤及肾功能衰竭逐渐成为研究的热点。斑马鱼胚胎在肾形态、生理和功能等方面在脊椎动物间高度保守，对化合物处理的反应与人类高度相似，是理想的肾毒性研究动物模型。目前，国内外关于斑马鱼胚胎肾毒性损伤方面的研究已有少量报道，对肾损伤的评价涉及形态学、病理结构及分子水平等不同层面。由于可直接在活体胚胎观察肾和细胞形态的细微变化，荧光标记的转基因斑马鱼在肾损伤研究中得到日益广泛的应用。

斑马鱼；胚胎；肾；毒性作用；模型，动物

DO l：10．3867／j．issn．1000-3002．2014．01．020

肾是机体的重要器官，能排出体内代谢产物及某些废物、毒物，调节机体水、电解质平衡，保证机体内环境的稳定。作为机体的主要排泄器官，肾极易受到体内各种代谢废物、毒物的影响，这些物质往往具有潜在的肾毒性。随着社会发展，金属、冶炼业、化工企业增多，加之医药及各种农药的滥用，环境污染日益加重，人群接触肾毒性物质的机会增加，中毒性肾病的发病率大幅增长。临床上肾毒物质导致的肾损伤，常表现为急性肾功能衰竭（acute renal failure，ARF），约占ARF的5%～25%。ARF起病凶险，死亡率高，严重威胁着人类健康。长期以来，人类一直在不断研究毒性肾损伤的致病机制和发病规律，积极寻找有效的预防和治疗药物。

目前关于肾毒性损伤方面的研究在动物模型上已开展较多，多数选用大鼠［1］、小鼠［2］、家兔［3］等哺乳动物，利用这些动物模型能很好地重现人类肾毒性损伤的典型症状和表现，但存在费用高、周期长、效率低等问题，而且无法在活体动物直接观察肾形态。斑马鱼是一种理想的脊椎模式生物，其基因组与人类基因组高度相似，已逐渐在发育生物学、化合物毒性评价和人类疾病模型研究等领域得到广泛应用。与其他动物模型比，斑马鱼具有产卵量大、发育周期短、药物用量少的优点，更适用于大规模活性成分的筛选。目前国内外关于化合物引起斑马鱼胚胎肾毒性损伤的研究已有少量报道，多集中于肾发育毒性方面，本文就此作一综述。

1 斑马鱼胚胎在肾毒性损伤研究中的应用优势

斑马鱼胚胎受精后14 h（14 hours，14 hp f）肾开始发育，72 hpf时肾发育完成［4］。最早在48 hp f可以观察到肾小球滤过现象［5］。斑马鱼发育第1周内，由于鳃还未发育完全，主要依赖肾排出体内多余的水分和代谢废物［6］，加之此阶段仔鱼不必喂食即可存活，干扰因素少，非常有利于开展肾毒性相关的研究。斑马鱼肾分为幼鱼期的前肾和成鱼期的中肾，前肾由一对肾单位组成，肾小球在背主动脉腹侧的胚胎正中线处融合，肾小管分居两侧［7］。前肾的解剖结构比成鱼的中肾及哺乳动物的后肾简单，但在细胞组成及分子水平上与哺乳动物的肾相似，并已具备同样复杂的生物功能［8］，许多肾毒性化合物引起斑马鱼胚胎肾损伤的表现与人类的表现相似［9］，在斑马鱼实验中得到的结果可应用于人类及其他模型。同时作为整体动物模型，选用斑马鱼胚胎非常利于研究毒性损伤时肾组织内肾小管、血管与免疫细胞间的联系及相互作用规律［10］。另外，肾与心脏在功能上紧密相关、相互影响［11］，对斑马鱼胚胎心脏形态及功能的观察简便易行，便于在肾毒性研究中综合考察心功能因素的影响。

2 斑马鱼胚胎肾毒性损伤的评价

2．1 形态变化

斑马鱼胚胎体形小、胚体透明，在镜下可清楚观察胚胎整体或局部一些器官的形态变化，斑马鱼胚胎在形态学观察方面具有独特优势。研究中胚胎经肾毒性化合物处理后，胚胎出现局部水肿（心包水肿［9］、眼水肿［12］和脑水肿［12］等）或全身水肿表现，与对照组比，处理组胚胎对环境渗透压的适应能力下降，在低渗环境中更容易形成水肿［9］，提示肾排水功能受到损害，调节体液平衡能力下降。利用肾荧光标记的转基因斑马鱼，可直接在荧光显微镜下观察活体胚胎的肾形态。斑马鱼Wt1b基因是Wt1的同系物，高表达于前肾管、前肾弓和肾小球，与肾发育及再生修复有关［13］，是肾发育的标志因子。Ding等［14］研究中用马兜铃酸10 mg·L－1处理Tg（wt1b∶GFP）斑马鱼胚胎24 h，镜下观察发现，胚胎出现前肾管、前肾弓囊性变及肾小球萎缩等形态异常改变（图1）。

图1 马兜铃酸（10 mg·L－1）处理后斑马鱼胚胎肾形A：正常斑马鱼胚胎（48 hp f）的肾；B：斑马鱼胚胎肾形态轻度异常，出现前肾管和前肾弓弯曲和囊性变，但肾小球形态正常；C：斑马鱼胚胎肾形态严重畸形，除前肾管和前肾弓异常外，出现肾小球萎缩和囊性变．pt：前肾管；pd：前肾弓；gl：肾小球．

2．2 病理学改变

斑马鱼胚胎肾的肾小球由血管球和包被于其周围的Bowman囊组成，结构整齐、致密，前肾管由单层上皮细胞包围形成一定大小的肾小管腔，正常组织结构是维持肾功能的基础。橘霉素（citrinin，CTN）和棒曲霉素（patulin，PAT）为真菌次生代谢物，存在于食品及饲料中，对动物多个器官具有毒性作用。Wu［15］等以斑马鱼胚胎为模型研究CTN和PAT的肾毒性，发现经CTN和PAT处理后的胚胎肾小球滤过率（glomerular filtration rate，GFR）降低，切片观察发现肾出现肾小球囊性变和肾小管上皮细胞排列紊乱、刷状缘被破坏等病理改变，但肾形态并无明显异常。在人类和其他哺乳动物，氨基糖苷类抗生素主要损害肾的肾小球和近端小管，Hentschel等［9］在研究中向胚胎注射氨基糖苷类抗生素，胚胎出现肾小球与肾小管囊肿、白细胞渗漏和管周聚集及肾小管内细胞碎片的积聚等肾损伤表现，这些都是人急性肾衰时的典型组织学特征。Na＋／K＋-ATP酶是维持动物细胞膜两侧的Na＋和K＋浓度梯度的膜结合酶，其α1亚单位在肾有高表达，为前肾管上皮细胞的标志物，肾毒性研究中利用其抗体α6F对整个胚胎或切片进行免疫染色，有助于肾定位及上皮细胞形态观察［16－17］。

2．3 肾小球滤过率

肾小球的滤过屏障由毛细血管内皮细胞、肾小球基底膜和足细胞的指状突构成，能滤过一些小分子、离子和液体成分。除病理改变外，肾损伤同时伴有GFR下降。GFR是反映肾功能的一个量化指标。斑马鱼胚体透明，在镜下可清楚观察血液循环。据报道，将荧光素（FITC）标记的右旋糖酐经胚胎心脏窦静脉注入循环血液内，于注射后不同时间测量心脏区域或眼睛瞳孔处的荧光强度，计算其衰减速率，以此估算GFR［18－19］。Shannon等［20］选用菊粉（inulin）作为清除物，与右旋糖酐一样，这些检测物质都具有在体内不分解，不与蛋白结合，能自由通过肾小球滤过屏障，且不被肾小管分泌或重吸收的特点。除与滤过屏障功能状态有关外，GFR还受肾血流量影响，心输出量降低时滤过率下降，因此计算GFR时要注意排除斑马鱼胚胎心功能因素的影响［18］。

2．4 胚胎体内肌酐含量

肌酐是肌肉的代谢产物，由前体化合物磷酸肌酸转化而成，主要由肾排出体外。肾功能受损时，肌酐在体内蓄积成为有害毒素，血清肌酐值升高，临床上检测血清肌酐值是了解肾功能的重要指标。目前已有的肌酐测定方法有Jaffe法、酶法、电泳法［21］、液相色谱法［22］和同位素稀释质谱法［23］等。但这些方法均以血清或尿液为样本，目前国内外针对组织样本中肌酐含量进行测定的研究未见报道。疾病导致机体病理生理发生变化，必然引起组织中代谢组分的变化，作为一类小分子代谢产物，组织内肌酐水平与肾功能状态密切相关。斑马鱼胚胎体形小，难以获取血清或尿液样本，在进行肾毒性损伤研究时，有必要考察胚胎体内的肌酐水平，以全面衡量肾功能状态。Soanes等［24］利用代谢组学方法分析了斑马鱼胚胎体内14种代谢组分在不同发育时期的含量变化，发现从胚胎发育15～48 hp f这一阶段内，包括肌酐在内的部分与能量代谢相关的代谢物含量呈逐步上升趋势，其研究中采用的组织提取方法取自于Wu等［25］的报道，他们的研究对斑马鱼胚胎组织中肌酐提取和测定方法的确立具有重要参考价值。

3 转基因荧光斑马鱼在肾损伤研究中的应用

随着基因操作和显微注射技术的成熟，目前已构建了种类繁多的荧光标记斑马鱼品系，这些转基因斑马鱼可表达清晰、明亮的荧光，有利于观察组织器官的精细变化。在肾相关研究中常用的Tg（wt1b∶GFP）斑马鱼胚胎，包括前肾管、前肾弓和肾小球在内的整个肾显示绿色荧光［14］，可直接观察毒性物质作用导致的肾形态变化。足细胞是肾小球滤过膜的重要组成部分，对维持正常肾小球滤过屏障功能至关重要，目前已确立多个与肾疾病相关的足细胞特异突变基因［26－27］。Zhou等［12］研究中将硝基还原酶基因与足细胞podocin基因启动子连接，并连一荧光报告基因，构建得到Tg（pod：NTR-mCherry）斑马鱼，在培养液中加入甲硝唑后，该Tg斑马鱼表达的硝基还原酶能将甲硝唑转化为细胞毒化合物，特异性地诱导足细胞凋亡，造成肾小球滤过屏障的破坏，利用此斑马鱼足细胞诱导损伤模型可进行肾疾病和足细胞修复方面的研究，并可直接通过胚胎体内荧光的强弱判断足细胞的凋亡情况。肾小球滤过屏障遭到破坏后，一些大分子蛋白如白蛋白透过滤膜渗漏到肾小管内而出现蛋白尿。为研究蛋白渗漏情况，Zhou等［12］将GFP融合到维生素D结合蛋白（vitamin D-binding protein，VDBP）的羧基端，并与脂肪酸结合蛋白基因（l-fabp）的启动子连接，构建得到（l-fabp：VDBP-GFP）转基因斑马鱼，能在肝内表达绿色荧光标记的融合蛋白并分泌入血液，其相对分子质量及等电点与白蛋白接近，可替代白蛋白追踪观察蛋白渗漏、近端小管蛋白的重吸收及聚集情况。

4 展望

研究发现，化合物导致肾毒性损伤后，斑马鱼胚胎体内包括促炎性因子［14－15］（如环氧合酶2，肿瘤坏死因子α，髓过氧化物酶和白细胞介素1β）、细胞凋亡因子［17］（p53，bcl-2）、致纤维化因子［28］、发育和修复相关因子［12］（W t1b）在内的多种因子的表达量发生改变，说明化合物引起的肾毒性损伤是涉及炎症反应、细胞凋亡、间质纤维化等多种机制在内的一个复杂过程，并同时伴有肾的再生修复过程［12］。肾在形态、生理及功能等方面在不同脊椎动物间具有高度保守性［29］，以斑马鱼胚胎为模型开展肾毒性损伤发生、发展和恢复过程的研究，将有助于人们加深对中毒性肾功能损伤及肾功能衰竭的认识，从而更好地预防肾损害的发生。深入研究肾损伤的分子机制、病理特点以及发生过程中相关因子的作用，也将为寻找能缓解和改善人类肾损伤的治疗药物和治疗方法提供可利用靶点。

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（本文编辑：付良青）

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Progress in application of zebrafish embryos in nephrotoxicity injury

WANG Xue，WNAG Xi-min，LIU Ke-chun，LIU Xin，HAN Li-wen，PENG Wei-bing，HE Qiu-xia，HOU Hai-rong
（Biology Institute of Shandong Academy of Sciences，Jinan 250014，China）

As the main excretion organ，the kidney is vulneroble to the toxic insult of internal or external compounds．More and more research is focused on the prevention or therapy of nephrotoxicity injury．Nephron shape，physiology and function are remarkably conserved among vertebrates．Zebrafish respond to toxic compounds in prettymuch the same way as humans．So zebrafish is an ideal model for nephrotoxicity research．Currently，kidney injury is mainly evaluated through morphological，pathological and molecular changes in many researches on nephrotoxicity of zebrafish embryos．Transgenic zebrafish labeled with fluorescence are widely used in the direct observation of fine changes of the kidneys or cells in living embryos．

zebrafish；embryo；kidney；toxic actions；model，animal

LIU Ke-chun，E-mail：hliukch＠sdas．org，Tel：（0531）82605352

R965．1

A

1000-3002（2014）01-0134-05

Foundation item：The project supported by National Natural Science Foundation of China（81202584）

2013-08-20 接受日期：2013-11-21）

国家自然科学基金（81202584）

王 雪，女，高级工程师，硕士，主要从事药物毒理学研究。

刘可春，E-mail：hliukch＠sdas．org，Tel：（0531）82605352