刘美霞，刘剑刚，李 浩，刘龙涛，梁 琳，胡 佳，魏 芸

（中国中医科学院西苑医院，1．老年病科，2．心血管疾病中心，北京 100091；3．北京化工大学化工资源有效利用国家重点实验室，北京 100029）

还脑益聪方提取物对淀粉样前体蛋白／早老蛋白1双转基因痴呆模型小鼠学习记忆能力的改善作用及其机制

刘美霞1，刘剑刚2，李 浩1，刘龙涛2，梁 琳1，胡 佳3，魏 芸3

（中国中医科学院西苑医院，1．老年病科，2．心血管疾病中心，北京 100091；3．北京化工大学化工资源有效利用国家重点实验室，北京 100029）

目的探讨还脑益聪方（HYD）提取物改善学习记忆能力的作用机制。方法3月龄淀粉样前体蛋白（APP）／早老蛋白1（PS1）双转基因小鼠，随机分为模型对照、盐酸多奈哌齐0．65 mg·kg－1、HYD提取物1．7和3．4 g·kg－1组，同龄C57BL／6J小鼠为正常对照。给药组小鼠ig给药，每日1次，连续6个月。给药结束后以跳台实验和Morris水迷宫实验观察小鼠行为变化，HE染色观察小鼠海马CA1区神经元形态变化，实时RT-PCR测定海马组织PS1、热休克蛋白70羧基端作用蛋白（CHIP）、鸟苷酸结合蛋白（CDC42）、呆蛋白（NCT）、激活蛋白-1（AP-1）和活化T细胞核因子（NFAT3）mRNA表达。结果与正常对照组比较，模型组小鼠跳台实验的错误次数增加（P＜0．05），潜伏期缩短（P＜0．01）；水迷宫实验的穿台次数减少（P＜0．05），潜伏期延长（P＜0．05）；海马CA1区神经元数量明显减少，形态结构有所破坏，PS1和CHIP m RNA表达均显著升高（P＜0．01）。与模型组比较，跳台实验中多奈哌齐、HYD提取物1．7和3．4 g·kg－1组小鼠的错误次数分别由模型组的5．1±1．2减少至2．2±1．1，2．7±1．2和2．1±1．2（P＜0．05），潜伏期由（70±27）s延长至130±33，162±33和（213±38）s（P＜0．01）；水迷宫实验中小鼠的穿台次数分别由2．1±1．8增加至3．5±1．9，3．6±2．0和3．8±1．8（P＜0．05），潜伏期由（139±57）s缩短至95±58，95± 58和（94±56）s（P＜0．05）；海马CA1区神经元数量明显增多，形态较完整；HYD提取物1．7和3．4 g·kg－1可明显降低APP／PS1双转基因小鼠海马PS1 mRNA表达（P＜0．05，P＜0．01），使CHIP mRNA表达进一步升高（P＜0．01），对CDC42，NCT，AP-1和NFAT3 mRNA表达均无明显影响。结论HYD提取物具有提高APP／PS1双转基因小鼠学习记忆能力的作用，该作用可能与其保护神经元和降低PS1 m RNA表达有关。

还脑益聪方；淀粉样前体蛋白；早老蛋白1；呆蛋白；小鼠转基因；神经行为学表现

DO l：10．3867／j．issn．1000-3002．2014．01．002

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）的发病机制尚不十分清楚，当前比较公认的主流学说之一是淀粉样β蛋白（amyloid beta protein，Aβ）级联假说［1］，且研究较为成熟。研究发现，γ分泌酶是催化Aβ生成的终末阶段，在Aβ产生中起着非常重要的作用，与AD的发生密切相关［2］。早老蛋白（presenilin，PS）和单过性跨膜蛋白呆蛋白（nicastrin，NCT）是γ分泌酶复合体的重要组成部分［3］，其活性的变化必然影响着AD的发生发展。还脑益聪方（Huannao Yicong decoction，HYD）是中国中医科学院西苑医院临床治疗认知功能障碍和AD的有效方药，其组成和制备工艺已获得国家发明专利［4］。前期研究表明，HYD能够抑制早期AD的发展，在一定程度上具有改善AD模型小鼠学习记忆行为、海马CA1区神经元病理形态、淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）及Aβ相关蛋白表达等作用［5－6］。本研究以APP／PS1双转基因痴呆小鼠为模型，观察HYD对小鼠学习记忆行为和海马CA1区神经元病理形态的影响，并探讨其对海马PS1和NCT调控通路的干预作用及可能的作用靶点。

1 材料与方法

1．1 动物、药物、试剂及仪器

3月龄APP／PS1双转基因小鼠，SPF级，体质量27～32 g，雌雄各半；3月龄C57BL／6J小鼠，SPF级，体质量27～32 g，均由中国医学科学院实验动物研究所提供，动物许可证号：SCXK（京）2009-0007。HYD由制何首乌、人参、石菖蒲、黄连和川芎按质量比2．4∶1．8∶2∶1∶1．2组成，中药饮片均由河北神农（北京）药业有限公司提供，HYD提取物由北京化工大学制定提取工艺，北京中医药大学中药学院制备［4，7］；盐酸多奈哌齐（donepezil hydrochloride），每片5 m g，国药准字：H20050978，由卫材（中国）药业有限公司生产。超纯RNA提取试剂盒、HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒、Rea lSuper Mixture（with Rox）和DNA酶Ⅰ，为北京康为世纪生物科技有限公司产品。DMS-2型Morris水迷宫系统，中国医学科学院药物研究所；BH-2型生物显微镜，日本Olympus公司；7500型荧光定量PCR仪，美国Applied Biosystems公司；DYY-GC型电泳仪，北京六一仪器厂；Tanon 1600型凝胶成像系统，上海天能科技有限公司。

1．2 还脑益聪方提取物的制备

HYD生药材用水提醇沉合并醇提的方式获取总提取物。按处方量称取石菖蒲，加8倍体积的水提取6 h，得挥发油、水提取液和药渣；称取制何首乌，与石菖蒲提取挥发油之后过滤的药渣合并，水煎3次，得水煎液，与石菖蒲提取挥发油后的水提取液混合，加4倍95%乙醇进行醇沉，所得醇沉液浓缩至稠浸膏状；按处方量称取人参、黄连和川芎混合，以70%乙醇回流2次，得醇提液浓缩至稠浸膏状；前两种浸膏与石菖蒲挥发油混合为总提取物。每克提取物相当于含生药3．2 g。

用高效液相色谱法测定结果表明，HYD提取物中含有大黄素、苯乙烯苷、人参皂苷Re、Rb1和Rg1、阿魏酸及小檗碱7种主要成分，其含量分别为0．8045，0．8765，0．6932，0．5816，0．3993，2．4183和1．0424 mg·g－1，以定性与定量相结合的方法进行质量控制，同时建立相应的指纹图谱（图1）。

1．3 动物分组和给药

Fig．1 Fingerprint map of Huannao Yicong decoction（HYD）extract detected with HPLC．1．ferulic acid；2．styrene glycosides；3．berberine hydrochloride；4．ginseng saponin Rg1；5．ginseng saponin Rb1；6．ginseng saponin Re；7．emodin．

实验前，用Morris水迷宫实验检测APP／PS1双转基因小鼠和同龄C57BL／6J小鼠逃避潜伏期，测得的正常小鼠平均逃避潜伏期为（91．8±56．2）s，APP／PS1双转基因小鼠平均逃避潜伏期为（138．8±57．1）s，分别以各自平均逃避潜伏期95%和99%正常值的上限值为界，潜伏期＞99%上限值（180s为上限）和＜95%上限值的小鼠予以剔除。筛选出60只APP／PS1双转基因小鼠随机分为模型、盐酸多奈哌齐0．65 mg·kg－1、HYD提取物1．7和3．4 g·kg－1组（相当于生药5．46和10．92 g·kg－1），每组15只，ig给药，每天1次，连续6个月。另取具有相同遗传背景的C57BL／6J小鼠15只为正常对照组，ig给予蒸馏水。给药结束后观察行为学变化。ig过程中因方法不当致盐酸多奈哌齐组小鼠死亡2只，HYD提取物1．7 g·kg－1组小鼠死亡1只，HYD提取物3．4 g·kg－1组小鼠死亡3只。

1．4 跳台实验检测一次性回避反应记忆功能

给药结束后，采用跳台实验检测一次性回避反应记忆功能。跳台箱为120 cm×12 cm×30 cm的有机玻璃箱，共分为6室（12 cm×12 cm× 30 cm），实验箱可允许6只小鼠同时进行实验。实验箱底面铺有铜栅，铜栅通过电线与电源相连，电流控制在36 V。实验箱内铜栅上靠箱内一角置一绝缘台（5．7 cm×4．5 cm×4．8 cm）作为动物回避电击的安全区。实验时将小鼠放入跳台仪实验箱内，适应环境5 m in之后将小鼠轻放于跳台上，并将铜栅通电，当小鼠从跳台上跳下四肢接触铜栅时会受到电击，正常回避反应是跳上跳台返回安全区，逃避电击，如此学习5 m in，并记录此5 m in内的触电次数（错误次数），以此为学习成绩。24 h后进行记忆能力测试，将小鼠置于跳台上，记录小鼠从停留在跳台上至第一次跳下受电击的时间即潜伏期和5 m in内的错误次数。

1．5 Morris水迷宫检测学习记忆和空间认知功能

跳台实验结束后，以Morris水迷宫实验检测APP／PS1双转基因小鼠学习记忆和认知功能。Morris水迷宫主要由一个圆形水池和自动录像及分析系统2部分组成，在池中加适量奶粉，混匀，使水成不透明的白色，达到动物视觉无法辨别池内有无平台的目的（APP／PS1双转基因小鼠为黑色），水池上方放置一个摄像头采集小鼠游泳轨迹。训练方法：实验时，从池壁第二象限1／2弧度处选择并标记1个入水点，将小鼠面向池壁放入水中，自动录像系统记录小鼠从入水至寻找并爬上平台所需时间（以四肢爬上平台为准）即逃避潜伏期和游泳路程，待小鼠爬上平台并在平台上休息10 s后，再进行下一只小鼠的实验。如小鼠在3 m in内未找到平台，则由实验者将其引导至平台停留10 s，逃避潜伏期记为180 s。每天进行1次，连续训练4 d。第5天上午正式实验，记录逃避潜伏期，同时记录穿越平台次数作为评价小鼠学习记忆能力（空间探索和定向航行2方面）的指标。

1．6 HE染色观察海马病理形态变化

行为检测结束后，每组随机取6只小鼠，麻醉处死，迅速取出脑组织，以冷生理盐水冲洗，置于冰块上，行矢状切割，随机取左侧或右侧半脑，4%中性多聚甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，切片。常规HE染色［8］，生物显微镜观察海马CA1区神经元形态变化。

1．7 RT-PCR检测早老蛋白1和呆蛋白及相关蛋白m RNA表达

行为检测结束后，每组随机选取6只小鼠，麻醉处死，迅速取出脑组织，以冷生理盐水冲洗，置于冰块上，行矢状切割，随机取左侧或右侧半脑，分离出海马，放入冷冻管于－80℃冰箱备用。用超纯RNA提取试剂盒提取组织样本中总RNA，取5μl用1%琼脂糖凝胶进行电泳。以β肌动蛋白作为内参照，用HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒按产品说明书进行逆转录，引物由北京华腾生威生物科技有限公司合成。引物序列如下，β肌动蛋白：上游5′-GCCTTCCTTCTTGGGTAT-3′，下游5′-GGCATAGAGGTCTTTACGG-3′；PS1：上游5′-ACAATGTCGCCGTGGACTACGTT AC-3′，下游5′-CTGAAATCACAGCCAAGATGAGCCA-3′；热休克蛋白70羧基端作用蛋白（carboxyl term inus of Hsc70-interacting protein，CHIP）：上游5′-AACTGGAGGAGTGTCAGCGGAAC-3′，下游5′-TCCATATCTGCCATGTATTTATCGTG-3′；鸟苷酸结合蛋白（GTP binding protein，CDC42）：上游5′-AGGGCAAGAGGATTATGACAGACTACG-3′，下游5′-GGGTCCCAACAAGCAAGAAAGG-3′；NCT：上游5′-CTGTATGAGCTTGCAGGAGGAACC-3′，下游5′-GAGACGGCGATGTAGTGTTGAAGAG-3′；激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）：上游5′-TCTACGCCAACCTCAGCAACTTC-3′，下游5′-ACGGTCTGCGGCTCTTCCTTC-3′；活化T细胞核因子3（nuclear factor of activated T cells，NFAT3）：上游5′-GGAGGAAGAGGCAGCGGTGAAC-3′，下游5′-CAGGTAGGAACTTGAAACTTTGGGTAGG-3′。用RealSuper Mixture（with Rox）进行扩增，扩增程序为：95℃10 m in，（95℃15 s，60℃60 s）×40个循环，在60～95℃进行融解曲线分析，并绘制目的基因和内参基因的标准曲线，采用2－△Ct法进行数据的相对定量分析。

1．8 统计学分析

2 结果

2．1 还脑益聪方提取物对APP／PS1双转基因小鼠一次性回避反应记忆功能的影响

由表1可见，与正常对照组比较，模型组小鼠触电的错误次数明显增加（P＜0．05），潜伏期缩短（P＜0．01）。与模型组比较，盐酸多奈哌齐、HYD提取物1．7和3．4 g·kg－1组触电错误次数减少（P＜0．05），潜伏期延长（P＜0．01）。

Tab．1 Effect of Huannao Yicong decoction（HYD）extract on one-time avoidant memory function of amyloid precursor protein／presenilin 1（APP／PS1）double transgenic mice

2．2 还脑益聪方提取物对APP／PS1双转基因小鼠学习记忆和空间认知能力的影响

由表2可见，与正常组比较，模型组小鼠穿台次数显著减少（P＜0．01），潜伏期显著延长（P＜0．05）；与模型组比较，多奈哌齐、HYD提取物1．7和3．4 g·kg－1组小鼠的穿台次数显著增加（P＜0．05），潜伏期显著缩短（P＜0．05，P＜0．01）；各用药组之间比较无显著性差异。

Tab．2 Effect of HYD extract on ability of learning and memory and spatial cognition of APP／PS1 double transgenic mice

2．3 还脑益聪方提取物对APP／PS1双转基因小鼠脑海马组织病理形态的影响

由图2可见，9月龄时正常组小鼠海马CA1区神经元染色均一，数量多，体积大，排列整齐、密集，细胞内结构完整，细胞膜、核膜清晰，核圆，核仁比较明显，少见细胞空泡变性及坏死（图2B）。模型组海马CA1区神经元数量明显减少，部分细胞胞体缩小，排列紊乱，细胞外空隙增大，细胞结构较模糊，胞膜核膜界限不清晰，胞核固缩深染，部分细胞出现空泡变性，甚至坏死（图2C）。连续给药6个月后，盐酸多奈哌齐组的神经元数量增多，细胞排列尚整齐，病理形态得到改善（图2D）。HYD提取物1．7和3．4 g·kg－1组小鼠的海马CA1区神经元数量较多，体积较大，细胞排列尚整齐，细胞结构基本清晰，核膜能分辨，核仁及胞质可见，偶见细胞出现空泡变性、细胞核固缩，少有细胞坏死（图2E和F），以HYD提取物3．4 g·kg－1组效果最为明显。

2．4 还脑益聪方提取物对APP／PS1双转基因小鼠PS1，CHIP和CDC42 m RNA表达的影响

提取的总RNA用1%琼脂糖凝胶电泳后，呈现出明显的RNA条带特征，可清晰观察到28，18和5 s条带，说明RNA纯度满足实验要求。RT-PCR结果（图3）表明，与正常组比较，模型组小鼠PS1和CHIP mRNA表达均显著升高（P＜0．01）。与模型组比较，多奈哌齐组PS1和CHIP mRNA表达无显著性差异，HYD提取物1．7和3．4 g·kg－1组PS1 m RNA表达均显著降低（P＜0．05，P＜0．01），CHIP m RNA表达均显著升高（P＜0．01）。各组之间CDC42 mRNA表达均无显著性差异。

2．5 还脑益聪方提取物对APP／PS1双转基因小鼠NCT，AP-1和NFAT3 m RNA表达的影响

图4结果显示，与正常组比较，模型组小鼠的NCT，AP-1和NFAT3 mRNA表达均无显著性差异；与模型组比较，HYD提取物1．7和3．4 g·kg－1组和多奈哌齐组小鼠的NCT，AP-1和NFAT3 m RNA表达均无显著性差异。

Fig．2 Effect of HYD on morphology of hippocampal CA1 neurons of APP／PS1 double transgenic mice under light microscope（HE×600）．See Tab．1 for the mouse treatment．A：anatomical location of CA1 in hippocampus（×150）；B：normal（C57BL／6J），C：model（APP／PS1），D：donepezil0．65 mg·kg－1；E：HYD 1．7 g·kg－1；F：HYD 3．4 g·kg－1．

Fig．3 Effect of HYD on PS1（A），carboxyl terminus of Hsc70-interacting protein（CHIP）（B）and GTP binding protein（CDC42）（C）m RNA expression in hippocampus of APP／PS1 double transgenic mice by RT-PCR．See Tab．1 for the mouse treatment．The target gene expression level was expressed as 2－ΔCt．1：normal（C57BL／6J）；2：model（APP／PS1）；3：donepezil 0．65 mg·kg－1；4：HYD 1．7 g·kg－1；5：HYD 3．4 g·kg－1．，n＝6．**P＜0．01，compared with normal group；＃＃P＜0．01，compared with model group．

Fig．4 Effect of HYD on nicastrin（NCT）（A），activator protein-1（AP-1）（B）and nuclear factor of activated T cells 3（NFAT3）（C）m RNA expression in hippocampus of APP／PS1 double transgenic mice by RT-PCR．See Tab．1 for the mouse treatment．1：normal（C57BL／6J）；2：model（APP／PS1）；3：donepezil 0．65 m g·kg－1；4：HYD 1．7 g·kg－1；5：HYD 3．4 g·kg－1．，n＝6．

3 讨论

APP／PS1双转基因小鼠是表达人类突变的APP基因和PS1基因的双转基因小鼠，APP的突变使得其与β分泌酶的结合位点发生结构改变，导致β分泌酶的活性升高，从而使Aβ的总量增加而加剧了老年斑的形成；PS1的突变可引起γ分泌酶的活性改变，从而导致APP的代谢过程发生变化，选择性地引起老年斑的主要成分Aβ1－42的产生和增加，因此能够很好地模拟早发并且逐渐进展的人大脑内的老年斑［9］。据报道，该小鼠在2．5月龄即开始出现细胞外Aβ沉积，大约在3月龄出现认知行为变化，5月龄出现老年斑，12月龄有大量老年斑形成［10－11］；其脑内出现Aβ沉积较早，而且与γ分泌酶活性有关，该小鼠是近年来被公认比较成功的转基因AD模型，也是从γ分泌酶调控通路研究药物干预的理想模型［12］。本研究应用经双转基因测定后选出的APP／PS1模型小鼠［10，13－14］，从3月龄进行早期干预研究，9月龄时APP／PS1双转基因小鼠跳台实验的错误次数显著增加，潜伏期显著缩短，水迷宫实验的穿台次数明显减少，逃避潜伏期显著延长，可见该年龄段小鼠确实已存在学习记忆能力的明显下降，适合作为AD模型进行相关研究。HYD是经过十余年的临床经验方，由制何首乌、人参、石菖蒲、黄连和川芎5味中药组成，其提取物的药物比例遵循原方比例，提取物的药物剂量由原方一日剂量按照动物体表面积换算而来［7］，HYD提取物1．7 g·kg－1相当于生药5．46 g·kg－1，为临床等效剂量；HYD提取物3．4 g·kg－1相当于生药10．92 g·kg－1，为临床等效剂量的2倍。跳台实验是反映小鼠一次性被动回避反应记忆功能的实验，Morris水迷宫是反映动物的空间学习记忆能力。经6个月用药干预后，盐酸多奈哌齐及HYD提取物1．7和3．4 g·kg－1组较模型组跳台错误次数显著减少，潜伏期显著增加，水迷宫穿台次数明显增加，潜伏期显著缩短，且各用药组之间无明显差异，表明HYD提取物有较好的改善APP／PS1双转基因AD小鼠学习记忆能力的作用，其作用效果与盐酸多奈哌齐相当。

神经元是神经系统结构和功能的基础，并以一定时空模式构成无数神经回路和神经网络，当神经元丢失到一定程度，会损伤脑的功能，首先受损的是认知功能，受累最严重的区域是海马，平均达47%，因此神经元的丢失与智能衰退的程度密切相关，是AD的一个重要病理特征［15］。本研究的病理结果显示，9月龄APP／PS1双转基因小鼠海马CA1区神经元数量较正常组小鼠明显减少，细胞排列紊乱，细胞结构损坏明显，部分细胞已坏死，说明神经元的丢失是APP／PS1双转基因小鼠认知行为学变化的一个重要原因。结果表明，HDY提取物1．7和3．4 g·kg－1组干预6个月后，可见APP／PS1双转基因小鼠海马CA1区神经元数量明显增多，细胞排列较整齐，细胞结构基本清晰完整，少见细胞坏死，说明HYD提取物具有保护神经元、减轻细胞损伤，达到改善认知功能的作用。

Aβ的大量产生并积聚是AD发生与否的关键所在，γ分泌酶在其中发挥了重要的作用，降低γ分泌酶的活性可以阻止或者延迟Aβ的产生，从而有望从根本上治疗AD［16］。γ分泌酶是由PS，APH-1，NCT和PEN-2 4部分组成的复合体，其中PS尤其是PS1为γ分泌酶的催化活性中心，被认为是γ分泌酶复合物中最重要的组分，其突变可使APP产生更长的Aβ，使之更易聚集最终形成老年斑［17］。实验研究显示，敲除编码PS1基因的小鼠，γ分泌酶活性降低80%，Aβ含量大大降低［18］，说明PS1是防治AD的一个很有潜力的靶点。CHIP和CDC42是与PS1有相互作用的重要细胞信号转导蛋白，CHIP的过表达可以减少NFT的形成，减少过度磷酸化Tau蛋白导致的细胞死亡，而其他的E3泛素连接酶，包括parkin和Cbl则没有泛素化磷酸化Tau蛋白的作用［19］。CDC42可能在神经元发育和神经细胞的迁移，PS1，APP的转运及调控PS1的转录等过程中起重要调节作用，可以认为CHIP和CDC42是PS1发挥对γ分泌酶活性调控的重要途径。本研究结果显示，9月龄APP／PS1双转基因小鼠脑海马组织中的PS1和CHIP m RNA表达明显高于正常小鼠，而CDC42 m RNA表达在两者之间无差异，考虑把APP／PS1双转基因小鼠作为AD模型的原因之一是脑海马组织的CHIP m RNA表达应激性增高，进而提高γ分泌酶的活性，促使APP裂解，Aβ生成增多，而CHIP m RNA表达又受到抑制。以HYD提取物干预6个月，能够促进CHIP m RNA的过度表达，从而破坏PS1的稳定性，降低γ分泌酶的活性，减少Aβ的生成，达到早期干预AD的目的，PS1和CHIP是其干预的主要靶点。NCT是γ分泌酶形成的支架和底物停靠位点［20］，其表达水平的改变对γ分泌酶活性和Aβ的产生起重要调节作用，与AD的发生发展密切相关［21］。AP-1与NFAT是NCT信号传导通路上的重要靶基因，直接参与了NCT的转录调控，其中AP-1的异常活化与Aβ沉积引起的毒性反应相关，NFAT信号通路与Aβ表达水平的增高直接相关［22］。本研究结果显示，正常C57BL／6J小鼠和APP／PS1双转基因小鼠的脑海马组织均有NCT，AP-1和NFAT3 mRNA的表达，但无显著性差异；给予HYD提取物其表达仍无显著性差异，这可能是例数较少的原因，也可能是因为NCT，AP-1和NFAT并非APP／PS1双转基因小鼠成为AD模型的作用途径，值得今后进一步探讨。

中药复方配伍是中医治病用药的主要特色，随着中药现代化的不断深入，中药作用靶点已深入蛋白和基因水平。本研究所用中药复方HYD经过现代工艺制备获得其提取物，确定了其主要有效成分，并明确了其具有改善学习记忆能力和保护海马神经元的作用，而且能够通过抑制PS1调控通路，主要作用于PS1和CHIP两个靶点而发挥干预AD的作用，体现中药复方多途径的作用特点，值得今后进一步验证。HYD作为防治AD的有效药物具有良好的研究开发前景。

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Effect and mechanism of Huannao Yicong decoction extract on learning and memory ability of dementia model of amyloid precursor protein／presenilin 1 double transgenic mice

LIU Mei-xia1，LIU Jian-gang2，LI Hao1，LIU Long-tao2，LIANG Lin1，HU Jia3，WEI Yun3
（1．Department of Geratology，Xiyuan Hospital，China Academy of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100091，China；2．Cardiovascular Center，3．State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering，Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029，China）

OBJECTlVETo investigate the effect and mechanism of Huannao Yicong decoction（HYD）extract on the learning and memory ability．METHODSThe 3-month-old amyloid precursor protein（APP）／presenilin 1（PS1）double transgenic mice were randomly divided into four groups：model，donepezil 0．65 m g·kg－1，HYD extract 1．7 and 3．4 g·kg－1．Besides，normal C57BL／6J m ice of the same age were taken as norm a l control group．All mice were administered through gastric infusion respectively，once daily for 6 months．The learning and memory ability of mice was observed by the diving platform test and Morris water maze after treatment be fore being sacrificed．The morphological changes of hippocampal CA1 neurons were observed by HE staining and the m RNA expression of PS1，carboxyl terminus of Hsc70-interacting protein（CHIP），GTP binding protein（CDC42），nicastrin（NCT），activator protein-1（AP-1）and nuclear factor of activated T cells 3（NFAT3）in the hippocampus were detected by real time-polymerase chain reaction（RT-PCR）．RESULTSCompared with the normal group，the wrong number of diving platform tests increased（P＜0．05），while the latency was reduced（P＜0．01）；the number of crossing the platform of Morris water maze decreased（P＜0．05），and the latency pro longed（P＜0．05）；the number of neurons decreased and cellular structure became unclearer in the hippocampal CA1 region；the expression of PS1 m RNA and CHIP m RNA increased significantly（P＜0．01）in model group．Compared with the model group，in the diving platform test，the wrong number of donepezil，HYD extract 1．7 and 3．4 g·kg－1groups was respectively reduced from 5．1±1．2 to 2．2±1．1，2．7±1．2 and 2．1±1．2（P＜0．05），and the latency prolonged from（70±27）s to（130±33），（162± 33）and（213±38）s（P＜0．01）．In the Morris water maze，the number of crossing the platform of donepezil，HYD extract1．7 and 3．4 g·kg－1groups respectively increased from 2．1±1．8 to 3．5±1．9，3．6±2．0 and 3．8±1．8（P＜0．05），and the latency shortened from（139±57）s to（95±58），（95± 58）and（94±56）s（P＜0．05）．The number of neurons was increased and cellular structure was clearer in the hippocampal CA1 region of mice．The expression of PS1 m RNA was decreased significantly（P＜0．05，P＜0．01）while the expression of CHIP m RNA was elevated（P＜0．01）in HYD extract 1．7 and 3．4 g·kg－1groups，but the expression of CDC42，NCT，AP-1 and NFAT3 m RNA was not significantly different．CONCLUSlONHYD extract can imp rove learning and memory ability of APP／PS1 double transgenic mice．The mechanism may be related to protection of neurons and decrease of the expression of PS1 mRNA．

Huannao Yicong decoction；amyloid precursor protein；presenilin 1；nicastrin；mice，transgenic；neurobehavioral manifestations

LI Hao，E-mail：xyhplihao1965＠126．com，Tel：（010）62887973；LIU Jian-gang，E-mail：liujiangang2002＠sina．com，Tel：（010）62835630

R971，R285．5

A

1000-3002（2014）01-0010-08

Foundation item：The project supported by National Natural Science Foundation of China（81173383）；and National Science and Technology Major Project（2009ZX09103-391）

2013-10-11 接受日期：2013-12-09）

（本文编辑：齐春会）

国家自然科学基金（81173383）；国家科技重大专项（2009ZX09103-391）

刘美霞（1978－），女，博士后，主要从事老年心脑血管疾病的研究；刘剑刚（1963－），男，副研究员，主要从事心脑血管疾病的基础研究；李 浩（1965－），男，主任医师，主要从事老年心脑血管疾病的研究。

李 浩，E-mail：xyhplihao1965＠126．com，Tel：（010）62887973；刘剑刚，E-mail：liujiangang2002＠sina．com，Tel：（010）62835630