谷蕴婷 于霞 李云絮 赵立平 王桂荣 陈素婷 黄海荣

结核病是全球严重的公共卫生问题，结核病疫情不但在发展中国家继续恶化,在许多发达国家也呈现回升趋势。目前全球已有20亿人感染结核分枝杆菌，而活动性结核病患者达1500万例，每年新增结核病患者约800～1000万例，每年有180万例因结核病死亡[1]。耐多药(multidrug-resistant, MDR)结核病和广泛耐多药(extensively drug-resistant, XDR)结核病的出现对药物敏感性试验(简称“药敏试验”)的准确性和可重复性提出了更高的要求[2-4]。INH是一种重要的一线抗结核药物，也是诊断MDR的药物之一，因此准确认定是否INH耐药对于患者的临床转归非常重要。

以罗氏(L-J)培养基为基础的药敏试验是一个在全世界范围内广泛使用的方法，尤其是在发展中国家。罗氏培养基常用的方法包括绝对浓度法和比例法，这两种方法的报告时间分别为4周和6周。国内临床机构多采用绝对浓度法药敏试验，在日常的绝对浓度法药敏试验临床检验工作中，个别菌株在含INH培养基上4周时无菌落生长而延长至6周后又有菌落生长。为了明确上述菌落形成的原因及其耐药性，本研究收集符合上述情况的菌株做进一步研究。

材料和方法

一、材料和试剂来源

1.菌株来源：首都医科大学附属北京胸科医院国家结核病临床实验室于2010年1—6月进行绝对浓度法药敏试验的菌株为546株，在37 ℃培养4周后，244株菌株对INH耐药[低度耐药和高度耐药临界值分别为0.2 μg/ml 和 1 μg/ml。收集绝对浓度法37 ℃含INH的L-J培养基上培养4周时无菌落生长、时间延长至6周后生长的13株菌株(含药培养基延迟生长菌株)，其中4株在INH浓度为1 μg/ml的培养基上有延迟生长，7株在在INH浓度为0.2 μg/ml的培养基上有延迟生长，2株在上述2个INH浓度的培养基上都有生长。这些菌株来源于11例结核病患者(2例患者的菌株在低浓度和高浓度INH培养基上均有菌落生长)；同时收集这11例结核病患者的临床敏感株作为对照菌株。共计24株菌株，此24株菌株均经过16S RNA和16S～23S间区序列测序后确定为结核分枝杆菌复合群。本研究经本院伦理委员会审查通过，所有患者均已签署知情同意书。

2.试剂和仪器：标准株H37RV来源于北京胸科医院参比实验室。2×PCR Taq MasterMix购自北京康为世纪生物科技有限公司；所用引物由上海生物工程技术服务有限公司合成；尼龙膜(Biodyne C)购自美国Pall Biosupport 公司；抗生蛋白链菌素-过氧化物酶结合物(streptavidin-peroxidase conjugate)和CDP-Star检测试剂购自美国GE公司。

二、方法

1．菌种鉴定：将含INH培养基上生长的13株菌株和普通罗氏培养基上生长的11株临床敏感菌株传代，在37 ℃培养3周，至有菌落生长。对传代培养的菌株进行水煮法粗提DNA，然后PCR扩增其16S RNA和16S～23S间区序列进行菌种鉴定[5-7]。引物序列和扩增条件见参考文献[8]。16S RNA 产物约800 bp, 16S～23S间区序列约400～600 bp，扩增产物由北京擎科新业生物技术有限公司进行测序。对比美国国立生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI) BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)在线数据库中的标准株确定其菌种。

2．菌株分型和突变分析：(1)间隔区寡核苷酸分型(spacer oligo-nucleotide typing, spoligotyping)检测：利用spoligotyping进行菌株的基因分型，操作方法如文献[9-10]所述。(2)分枝杆菌散在分布重复单位(Mycobacterium interspersed repetitive unit，MIRU)分型法：采用Cowan等[11]的方法，选择12位点，进行测定分析。(3)耐药基因突变测定：PCR扩增与异烟肼耐药相关的基因片段katG和inhA，后进行测序分析，具体操作参考文献[12]。

3．比例法药敏试验：对收集的24株菌株均进行比例法药敏试验，以确定其对INH的敏感性，INH药物浓度为0.2 μg/ml,具体操作参照《结核病诊断实验室检验规程》[13]进行。

4．不同比例混合菌株在不同报告时间的绝对浓度法药敏试验：为了探讨混合感染对药敏试验的影响，进行人工模拟不同比例INH敏感菌株和耐药菌株的混合，观察不同报告时间(4周和6周)，药敏试验结果是否出现差异。选择对照菌株和含药培养基延迟生长菌株MRIU分型不同的3例菌株(7019H0.2,7285H0.2和7325H1)，分别与H37Rv按照以下比例混合：100∶0；1∶2；1∶4；1∶8；1∶16；1∶32；1∶64；1∶128；1∶256；0∶100。药敏试验采用绝对浓度法，INH浓度分别为1 μg/ml、0.2 μg/ml。具体操作参照《结核病诊断实验室检验规程》[13]进行。

5.质量控制(简称“质控”)：质控均以标准株H37Rv和阴性对照进行。对于不合理的质控结果，采取重新检测质控样品再次进行实验。

三、资料收集及数据处理

电话随访所纳入的11例患者在首次就诊后的2年内是否再次入院，以及再次就诊时绝对浓度法药敏试验中对INH的耐药情况。涉及的数据采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。

结 果

1.菌株分型和耐药基因突变情况:间隔区寡核苷酸分型显示仅有3株表现为非北京基因型，其余21株均为北京基因型。MIRU分型显示11例患者中有5例患者的对照菌株和分型不同。13株含药培养基延迟生长菌株中10株存在S315T突变。编号9,10,11的患者对照菌株和含药培养基延迟生长菌株spoligotying分型不一致。具体基因分型和耐药突变情况(表1)。

2.比例法药敏试验: 比例法药敏试验结果显示13株含药培养基延迟生长菌株均为INH耐药，而11株对照菌株均为INH敏感。

3.混合菌株在不同报告时间的绝对浓度法药敏试验结果: 当H37Rv与7325H1按不同比例混合后，比例为1∶128和1∶256的混合菌株在4周后在培养基上没有菌落生长；而6周菌落数低浓度INH培养基的菌落数分别为29和12；高浓度INH的菌落数分别为6和3。H37Rv与7019H0.2按不同比例混合后，比例为1∶64、1∶128和1∶256的混合菌株在4周后低浓度INH培养基的菌落数分别为15、10和3；6周后的菌落数分别为50、20和11(表2)。

表1 纳入的11例患者的分型和耐药突变结果

4.随访结果:11例患者中有3例在本次就诊后2年内再次入院，均为菌阳患者且绝对浓度法药敏试验均显示对INH耐药。具体患者信息和随访信息见表3。

表2 人工混合感染模型4周和6周的药敏试验结果

表3 纳入的11例患者的基本信息和随访信息

讨 论

中国是结核病高负担国家，全国结核病耐药性基线调查报告显示，初治患者和复治患者INH的耐药率分别为16%和38.5%[14]。本研究样本收集期间，收集菌株中对INH的耐药率已经达到44.7% (244/546)。本研究纳入的11例患者中,有3例患者在本次就诊后2年内再次入院的药敏试验结果证实为对INH耐药, 且这3例患者均使用INH进行抗结核治疗。本研究结果同时表明，13株含药培养基延迟生长菌株通过比例法药敏试验均证实为对INH耐药的菌株。提示在国内结核病高耐药的背景下，应该高度警惕对INH耐药的假阴性现象。

尽管绝对浓度法药敏试验包括对硝基苯甲酸(PNB)鉴定，但有部分非结核分枝杆菌会对500 μg/ml 的PNB敏感[15]。本研究为了排除非结核分枝杆菌的影响，利用PCR对菌株做了菌种鉴定，并利用spoligotyping技术对24株待测菌株做了基因分型。结果显示，11株来自普通罗氏培养基生长的对照株和13株含药培养基延迟生长菌株均为结核分枝杆菌复合群，其中仅有3株表现为非北京基因型，其余21株均为北京基因型。

有研究显示，平均17%高发病率地区的新发结核病患者均为多重感染[16]。Shen 等[17]研究表明，在上海52例复发的结核病患者中，32例(32/52，61.5%)患者第一次和第二次感染的菌株属于不同的型别。这个结果表明，外原性再感染在高发病国家很常见。本研究spoligotying 分型结果表明，11例患者中3例患者对照株和含药培养基延迟生长菌株拥有不同的型别，其中2例患者的含药培养基延迟生长菌株属于北京基因型而对照培养基为其他分型，另外1株正好相反；MIRU分型结果提示，11例患者中5例患者中的对照株和含药培养基延迟生长菌株拥有不同的型别，提示这5例患者同时感染了对INH耐药和敏感的2种菌株，既患者的一份痰标本中包含着2种不同比例的对INH耐药和敏感的菌株。选择3株对照株和含药培养基延迟生长菌株MIRU分型不同的菌株，与结核分枝杆菌标准株H37Rv按照不同比例混合后，观察不同报告时间的药敏试验结果。结果证实，当耐药菌株的比例较低，如耐药与敏感菌株的比例小于1∶128时，就可能会出现含INH培养基4周时无菌落生长而6周后有菌落生长的情况。

细菌在长期的药物作用下会出现耐药突变[18]。因此，本研究中的含药培养基延迟生长菌株的生长延迟现象可能由体外耐药突变引起。Viveiros等[18]研究表明，经体外诱导对INH高度耐药的菌株并不存在katG基因S315T突变。该研究选择H37Rv和8株对INH敏感的临床分离株，通过在刚刚低于最低抑菌浓度(MIC)的药物浓度中培养，经过6代后，这些菌株对INH的MIC值均>20 μg/ml。而本研究中，10株(10/13, 76.92%)菌株存在S315T突变，仅将报告时间延长2周似乎不足以诱导细菌在体外发生S315T突变，因此可以推断本研究中部分伴有S315T突变的含药培养基延迟生长菌株可能源于体内,但是也不能排除外来感染的可能性。

本研究仅选择INH作为代表药物来解释对于敏感菌株延长药敏试验时间的必要性。由于这样的菌株数量很少，所以很难获得一个大量的样本。本研究的目的是解释一个现象，因此样本的数量可能足够。

综上所述，INH作为主要的抗结核药物之一，其药敏试验的准确性对于治疗至关重要。对于同一患者的药敏试验结果的不一致，尤其是前一份结果耐药，后一份结果敏感的情况，应该警惕耐药结果的假阴性。本研究中，大约2% (11/546) 的患者在延长药敏试验报告时间后菌株对INH由敏感变成耐药。如果延长2周的孵育时间，会导致这部分患者的治疗方案发生变化。

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