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(青岛大学医学院,山东 青岛 266003 1 附属医院乳腺外科； 2 生物化学与分子生物学教研室)

乳癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，我国乳癌的发病率在近20年呈逐渐上升趋势，尤其在京、津、沪等大城市，乳癌已位居女性恶性肿瘤发病率之首，严重危害女性健康[1]。micro RNAs(miRNAs)是一类由22个氨基酸组成、高度保守的单链非编码RNA， 广泛存在于真核细胞生物中，具有转录后基因调控功能。成熟的miRNAs通过碱基互补配对的方式与靶mRNA的编码序列(CDS)或3′-非翻译区(3′-UTR)结合，引起靶mRNA 的翻译抑制或切割降解。miRNAs 具有多种生物学功能，在细胞发育、分化、增殖、凋亡过程发挥调控作用[2-4]。研究显示, miRNA 10b(miR-10b)、miRNA 195(miR-195)在多种肿瘤细胞中表达均下调，与肿瘤的发生发展密切相关。本文通过研究miR-10b、miR-195在乳 癌组织中的表达及其与乳癌临床病理特征之间的关系，探讨miR-10b、miR-195在乳癌发生、发展中的作用。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 标本及其来源

乳癌及癌旁组织(距肿瘤边缘≥5 cm)标本40例，取自我院2013年1—6月期间手术病人，均为女性，年龄28～77岁，中位年龄49.6岁。经术后病理检查诊断为浸润性导管癌。所有病人术前未接受放疗、化疗及内分泌治疗。

1.2 实验试剂及引物

RNAiso Plus(Total RNA提取试剂)及SYBR荧光定量试剂盒(SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ)均由宝生物工程(大连)有限公司提供，逆转录试剂盒(BioRT Two Step RT-PCR Kit)购自博日科技有限公司。引物根据miRBASE数据库设计，以U6作为内参，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成，引物序列见表1。

表1 各引物序列

注：a通用正向引物，b茎环引物，c正向引物，d反向引物。

1.3 检测指标及方法

1.3.1TRIzol法提取总RNA 按Total RNA 提取试剂所示步骤提取组织中的总RNA，用紫外线分光光度计检测总RNA浓度及其波长在260 nm和280 nm处吸光度(A)值，所得A260/280值均在1.8～2.0之间。

1.3.2miR-10b、miR-195表达检测 采用实时荧光RT-PCR 方法。参照SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ及BioRT Two Step RT-PCR Kit说明书进行逆转录及PCR反应，反应体系均为10 μL。逆转录反应条件为：55 ℃ 45 min，95 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min；PCR反应条件为：94 ℃预变性10 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s， 72 ℃延伸30 s，30个循环。以U6为内参基因,对目的基因进行均一化处理,根据荧光阈值(CT值)计算miR-10b、miR-195相对表达量，计算公式为2-△△CT。其中△CT=CT目标miRNA-CTU6，△△CT=△CT癌组织-△CT癌旁组织。

1.4 统计学处理

应用SPSS 16.0软件进行统计学处理，数据间比较采用t检验，相关性分析采用Mann-Whitney U检验。

2 结 果

2.1 乳癌及癌旁组织miR-10b、miR-195表达比较

癌旁组织中miR-10b及miR-195的表达量为1.00,miR-10b、miR-195在乳癌组织中的相对表达量分别为0.35±0.40、0.44±0.46，乳癌组织与癌旁组织miR-10b、miR-195表达比较，差异有统计学意义(t=4.35、5.71，P<0.05)。

2.2 乳癌组织miR-10b、miR-195表达与临床病理特征之间的关系

肿瘤直径>5 cm的乳癌组织中miR-195表达较直径≤5 cm者低，有淋巴结转移及间质脉管癌栓的乳癌组织中miR-195表达明显低于无淋巴结转移、无间质脉管癌栓的乳癌组织，差异均有显著意义(U=-2.127～-2.083，P<0.05)；miR-10b表达与肿瘤大小、淋巴结转移及间质脉管癌栓等均无相关性(P>0.05)。miR-10b、miR-195表达与肿瘤TNM分期、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)及人表皮生长因子受体-2(Her-2)水平均无明显相关性(P>0.05)。见表2。

表2 miR-10b、miR-195表达与乳癌临床病理特征的关系

3 讨 论

2002年，CALIN等[5]首次报道miRNAs表达异常与肿瘤相关，之后，众多研究小组在多种人类肿瘤组织中检测到miRNA异常表达。这些异常表达的miRNAs作用类似于癌基因或抑癌基因，如miRNA155作为癌基因，在一些淋巴瘤亚型中过度表达；而miRNA143和miRNA145作为抑癌基因在结、直肠癌的表达水平下降[6]。与乳癌相关的miRNAs目前也有报道。IORIO等[7]通过对10例正常乳房组织和76例乳癌组织miRNAs的表达水平进行比较，证实miR-125b、miR-145、miR-155和miR-21在乳癌中表达显著下调，其中miR-155降低程度尤为明显，miRNAs的表达水平与乳癌的病理生理学特征相关，如病理学分期、增殖指数、ER/PR表达[8]及血管受侵等。TAVAZOIE等[9]研究了一系列与乳癌转移密切相关的miRNAs，其中miR-335、miR-206与miR-126对肿瘤转移的抑制发挥着关键性作用。miR-195位于染色体17p13.1，属于miR-15/16/195家族，该家族与肿瘤发生、发展密切相关。早期研究结果显示，miR-195在肥大心肌细胞中过度表达，可致转基因小鼠病理性心脏生长及心力衰竭。近期研究显示，miR-195在多种肿瘤组织表达下调，包括胃癌[10]、肝癌[11]、膀胱癌[12]等。LI等[13]应用miR-195转染MCF7及ZR-75-30细胞系，结果显示miR-195高表达可显著抑制细胞集落形成，诱导细胞G1期阻滞。已有研究显示，原癌基因丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(Raf-1)亦是miR-195的作用靶点，引入miR-195则可以抑制Raf-1的表达[14]。Raf-1在MAPK/ERK信号转导通路中发挥作用，活化的Raf-1能够调节细胞周期、细胞迁移、凋亡及分化。本实验结果显示，miR-195在乳癌组织中表达明显下调，其表达水平与肿瘤大小、淋巴结转移及脉管癌栓侵犯有关，与肿瘤TNM分期、ER、PR及Her-2水平无明显相关性。提高miR-195可能对肿瘤的生长、浸润、转移起抑制作用。

有研究显示,miR-10b能够促进肿瘤细胞侵袭及转移，其在转移性乳癌中表达增高[15]。此外，非浸润性乳癌组织中miR-10b表达上调可致肿瘤侵袭和转移能力显著增强。Twist是一种凋亡抑制蛋白，它可以与miR-10b启动子区结合并诱导其表达，造成促转移基因(RHOC)表达增加，从而引起肿瘤的侵袭及转移[16]。本文研究结果显示，miR-10b在癌组织中表达下调，其表达水平与肿瘤大小、有无脉管癌栓、TNM分期及ER、PR、Her-2水平等均无明显相关性。说明miR-10b可能主要在肿瘤进展晚期发生远处转移的阶段发挥作用。

综上所述，miR-10b及miR-195在乳癌组织中表达明显下调，可能在乳癌发生、发展中发挥作用，可作为筛查和诊断乳腺肿瘤的潜在生物学指标。

[参考文献]

[1]邵志敏,沈镇宙,徐兵河. 乳腺肿瘤学[M]. 上海:复旦大学出版社, 2013:1-5.

[2]HE L, HANNON G J. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation[J]. Nat Rev Genet, 2004,5(7):522-531.

[3]VASUDEVAN S, TONG Y, STEITZ J A. Switching from repression to activation: microRNAs can up-regulate translation[J]. Science, 2007,318(5858):1931-1934.

[4]张腾龙,张鹏,孟月生,等. 多发性骨髓瘤组织微小RNA-19表达及其临床意义[J]. 齐鲁医学杂志, 2013,(1):14-16.

[5]CALIN G A, DUMITRU C D, SHIMIZU M, et al. Frequent deletions and down-regulation of micro-RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002,99(24):15524-15529.

[6]BOMMER G T, GERIN I, FENG Y, et al. p53-mediated activation of miRNA34 candidate tumor-suppressor genes[J]. Curr Biol, 2007,17(15):1298-1307.

[7]IORIO M V, FERRACIN M, LIU C G, et al. MicroRNA gene expression deregulation in human breast cancer[J]. Can-cer Res, 2005,65(16):7065-7070.

[8]JIANG S, ZHANG H W, LU M H, et al. MicroRNA-155 functions as an OncomiR in breast cancer by targeting the suppressor of cytokine signaling 1 gene[J]. Cancer Res, 2010,70(8):3119-3127.

[9]TAVAZOIE S F, ALARCON C, OSKARSSON T, et al. Endogenous human microRNAs that suppress breast cancer metastasis[J]. Nature, 2008,451(7175):147-152.

[10]GUO J, MIAO Y, XIAO B, et al. Differential expression of microRNA species in human gastric cancer versus non-tumorous tissues[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2009,24(4):652-657.

[11]XU T, ZHU Y, XIONG Y, et al. MicroRNA-195 suppresses tumorigenicity and regulates G1/S transition of human hepatocellular carcinoma cells[J]. Hepatology, 2009,50(1):113-121.

[12]ICHIMI T, ENOKIDA H, OKUNO Y, et al. Identification of novel microRNA targets based on microRNA signatures in bladder cancer[J]. Int J Cancer, 2009,125(2):345-352.

[13]LI D, ZHAO Y, LIU C, et al. Analysis of miR-195 and miR-497 expression, regulation and role in breast cancer[J]. Clin Cancer Res, 2011,17(7):1722-1730.

[14]VAN ROOIJ E, SUTHERLAND L B, LIU N, et al. A signature pattern of stress-responsive microRNAs that can evoke cardiac hypertrophy and heart failure[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006,103(48):18255-18260.

[15]MA L, TERUYA-FELDSTEIN J, WEINBERG R A. Tumour invasion and metastasis initiated by microRNA-10b in breast cancer[J]. Nature, 2007,449(7163):682-688.

[16]BIAGIONI F, BOSSEL BEN-MOSHE N, FONTEMAGGI G, et al. miR-10b, a master inhibitor of the cell cycle, is down-regulated in human breast tumours[J]. EMBO Mol Med, 2012,4(11):1214-1229.