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(青岛大学医学院，山东 青岛 266021 1 生物化学与分子生物学教研室； 2 微生物学教研室； 3 附属医院乳腺外科； 4 2010级七年制临床医学专业)

乳癌是全球性的女性常见恶性肿瘤之一,严重威胁着妇女的健康，在中国许多大中城市，乳癌已跃居女性恶性肿瘤的第一位[1]。该肿瘤隐匿期长，早期发现及早治疗非常重要。近年来在乳癌的发病机制研究方面取得了一定进展，但对其早期诊断和临床治疗并没有实质性突破。Toll 样受体(TLRs)是新近发现的参与非特异性免疫(天然免疫)的一类重要蛋白质分子，也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁。TLRs可以营造炎症微环境导致肿瘤形成，并在肿瘤形成基础上促进肿瘤进展。研究结果显示，TLRs不仅在免疫系统细胞表达，也广泛表达于肿瘤细胞[2-3]。在肿瘤发生发展中 TLRs 信号有重要作用。TLR2 和TLR4 在乳癌组织表达及其在肿瘤发生发展中的作用尚未明了，本研究通过检测乳癌组织中TLR2 和TLR4 的表达，探讨其与乳癌发生发展的关系，并探讨其临床意义。

1 材料与方法

1.1 标本来源

随机收集青岛市中心医院和青岛大学医学院附属医院2010年7月—2012年3月收治，经病理组织学确诊的乳癌病人的新鲜癌组织及相应癌旁组织(距肿瘤边缘≥5 cm)213例。所有病人均为女性，年龄32～80岁，中位年龄54.3岁。病理类型：浸润性非特殊型癌209例(其中浸润性导管癌198例，浸润性小叶癌4例，髓样癌5例，基底细胞样癌2例)，浸润性特殊型癌4例(均为乳头状癌)。应用国际抗癌联盟的TNM分期法分期：T1期98例，T2期115例；N0期122例，N1期45例，N2期33例，N3期13例；M0期213例。所有病人术前均未接受过新辅助化疗、内分泌治疗及放射治疗，并除外双侧原发乳癌和合并其他恶性肿瘤病人。

1.2 主要试剂

HotstarTaq DNA聚合酶由大连TaKaRa公司提

供；逆转录(RT)试剂盒购自立陶宛MBI Fermentas公司扩增；引物由南京金思瑞生物工程技术服务有限公司合成；QuantiFast SYBR Green PCR Kit购自德国QIAGEN公司。

1.3 RNA提取与纯化

采用TRIzol一步法提取组织总RNA，具体步骤按照说明书进行操作。灭活所提取的RNA样品中混杂的DNA并纯化RNA样品。

1.4 TLR2和TLR4 mRNA检测

1.4.1RT-PCR ①引物设计：TLR2和TLR4及内参照基因GAPDH引物序列见表1。②cDNA的合成：采用RT试剂盒进行cDNA合成，具体操作步骤按说明书进行。RT完成后，cDNA样本于-80 ℃保存备用。③PCR扩增：用上述合成的cDNA作模板进行TLR2和TLR4扩增，内参照GAPDH扩增的上下游引物各0.4 μmol/L(1.0 μL)，其他反应体系与条件同前。并用ddH2O作为空白对照。

1.4.2PCR扩增产物检测 将PCR扩增产物于含有0.5 mg/L溴化乙锭的15 g/L琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像系统记录并分析电泳结果。

表1 TLRs和GAPDH RT-PCR引物

1.4.3Real-time PCR检测 以上述合成的cDNA为模板，按照QuantiFast SYBR Green PCR Kit试剂盒说明进行Real-time PCR反应，从上述213例乳癌组织及其癌旁组织中随机抽取30例对TLR2和TLR4基因的mRNA表达量进行定量分析比较。以GAPDH基因作为内参照，每份RNA样品均进行3次重复检测，取其平均Ct值用于分析。扩增引物由南京金斯瑞生物工程技术服务有限公司设计合成，引物序列及产物大小同1.4.1。根据所得Ct值，应用2-△△Ct法计算乳癌组织及其相应癌旁组织中TLR2和TLR4相对表达量，每次实验均重复3次。

1.5 统计学分析

2 结 果

2.1 TLR2与TLR4 mRNA的表达

2.1.1TLR2 mRNA的阳性表达 部分乳癌及其相应癌旁组织TLR2 mRNA RT-PCR检测的电泳结果见图1，TLR2基因扩增条带长度为264 bp，内参照基因GAPDH扩增条带长度为469 bp。乳癌组织及其相应癌旁组织TLR2的阳性表达率分别为92.49%(197/213)和71.3%(152/213)，乳癌组织TLR2阳性表达率明显高于其相应癌旁组织，差异有显著意义(χ2=32.10，P<0.01)。

2.1.2TLR4 mRNA的阳性表达 部分乳癌及其相应癌旁组织TLR4 mRNA RT-PCR检测的电泳结果见图2，TLR4基因扩增条带长度为510 bp，内参照基因GAPDH扩增条带长度为469 bp。乳癌组织及其相应癌旁组织TLR4的阳性表达率分别为95.78%(204/213)和41.78%(89/213)，乳癌组织TLR4阳性表达率明显高于其相应癌旁组织，差异有显著意义(χ2=144.57，P<0.01)。

A：乳癌组织；B：癌旁组织；M：DL2000 DNA Marker；①阴性质控；②～乳癌组织及癌旁组织。

图1RT-PCR检测部分标本TLR2mRNA表达

A：乳癌组织；B：癌旁组织；M：DL2000 DNA Marker；①阴性质控；②～乳癌组织及癌旁组织。

图2RT-PCR检测部分标本TLR4mRNA表达

2.2 乳癌组织TLRs表达与临床病理因素关系

乳癌组织中TLR2和TLR4 mRNA表达与肿瘤的组织学分级以及雌激素受体(ER)阳性表达、孕激素受体(PR)阳性表达均有关(χ2=4.06～30.86，P<0.05)，而TLR2 mRNA表达与抑癌基因p53的表达也有关(χ2=5.71，P<0.05)。见表2。

表2 乳癌组织TLRs表达与临床病理因素关系(例(χ/%))

2.3 Real-time PCR检测TLRs mRNA表达水平

乳癌组织和癌旁组织中TLR2 mRNA相对表达量分别为0.79±0.10、0.65±0.15，TLR4 mRNA相对表达量分别为0.81±0.12、0.67±0.16。乳癌组织TLR2和TLR4 mRNA表达量显著高于其相应癌旁组织(t=4.26、3.89，P<0.05)。

3 讨 论

TLRs广泛分布于免疫细胞尤其非特异免疫细胞或细胞器膜的表面，是进化过程中比较保守的一个受体家族，是感受病原体入侵的主要受体之一[4]。很多研究显示，肿瘤发展与慢性炎症密切相关，多种肿瘤的生物学行为与介导炎症的TLRs密切相关。TLRs在不同的肿瘤细胞表达有差异，并且在肿瘤的发生、发展、耐药和侵袭过程中发挥重要作用。目前已发现的TLRs家族至少包括12个成员，不同的TLRs其配体也有所不同。

TLR2识别谱较广，可识别大部分已发现的病原体相关分子模式(PAMP)结构，其不仅是机体介导天然免疫反应的重要分子，而且在组织修复的过程中也发挥着重要作用。研究认为，在肿瘤发生前，TLR2信号途径的持续激活是慢性炎症持续存在进而发展为恶性肿瘤的重要原因[5]。近年来研究显示，TLR2在很多肿瘤细胞系和肿瘤组织中表达上调，尤其是上皮来源的肿瘤。但乳癌组织中TLR2的表达情况尚不清楚。本研究结果显示，乳癌组织TLR2的表达明显上调，其在N3期(淋巴结转移)的表达比N0期有较明显的增高趋势，说明TLR2在一定程度上促进了癌细胞的增殖，参与乳癌的转移，提示TLR2可能通过激活TLRs信号通路参与乳癌的恶性进程，进而影响病人预后；而肿瘤的组织学分级越高，TLR2的表达率越高，提示TLR2有可能成为肿瘤分化不良的重要标志。YANG等[6]对黑色素瘤研究显示，肿瘤细胞释放的HSP60持续激活TLR2通路，进而激活信号转导和转录激活因子，导致免疫抑制细胞因子和趋化因子释放，促进黑色素瘤细胞的增殖和浸润，而针对TLR2的治疗能显著降低肺部的转移，增加荷瘤鼠的存活。我们推测，乳癌与其他肿瘤一样，在肿瘤微环境内可能也存在着TLR2内源性配体，激活乳癌细胞TLR2信号通路，从而引起局部炎症样反应，并通过上述类似的机制促进癌细胞的增殖、凋亡抵抗等。因此，TLR2有望成为乳癌预后判断指标和新的治疗靶点。

TLR4普遍表达于多种肿瘤细胞，肿瘤的发展与TLR4参与激活的信号通路有密切关系。近年研究显示，TLR4在很多肿瘤细胞系和肿瘤组织中表达上调。它表达于多种肿瘤细胞中，如人头颈鳞状细胞癌[7]、结直肠癌[8]、胃癌[9]、卵巢癌[10]、宫颈癌[11]、肺癌[12]、前列腺癌、黑色素瘤[13]、乳癌[14]、胰腺癌等。TLR4在乳癌组织中的表达尚少见报道。本研究结果显示，乳癌组织TLR4表达明显上调，其表达与肿瘤的组织学分级、T分期和ER、PR的状态均有关。肿瘤的组织学分级越高，TLR4的表达率越高，TLR4可能参与了肿瘤的恶性进程，有可能成为肿瘤分化不良的重要标志，提示TLR4可能通过激活TLRs信号通路参与乳癌的恶性进程，进而影响病人预后。T2期TLR4的表达显著高于T1期，说明TLR4可能促进肿瘤细胞的增殖，影响肿瘤的发展进程；ER阳性组TLR4的表达显著高于ER阴性组；与PR阴性组比较，PR阳性组中TLR4的表达也有显著增高。乳癌是一种雌激素依赖性肿瘤，研究表明，ER、PR与乳癌的组织分化和预后有密切联系，ER、PR阳性往往预示着病人预后较好，而本研究中ER、PR阳性乳癌组织中TLR2和TLR4的表达明显升高，与预期结果不符，这可能与我们收集的乳癌标本中ER、PR阴性例数太少有关，在后期的研究中需扩大标本例数做进一步研究。TLRs是近年来肿瘤免疫学的研究热点。其促进肿瘤发生、侵袭转移、复发、免疫逃逸的分子机制尚待进一步深入研究。TLRs在乳癌发生发展中作用的研究尚少见报道，国内几乎未见相关研究报道。

总之，本研究TLR2和TLR4在乳癌组织的表达结果提示，TLRs在乳癌的发生发展中发挥重要作用，可能通过激活TLRs信号通路参与乳癌的进程。TLR2和TLR4有望成为乳癌的预后判断指标和新的治疗靶点。对TLRs信号通路的分子机制进行深入研究，将为肿瘤生物治疗提供新的策略，从而提高病人生存期和改善预后。

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