何　静　夏　虹　张昌明　刘志红　施少林

线粒体是真核细胞内主管能量代谢的细胞器。不同类型细胞内线粒体的数量从几百个到几千个不等。线粒体DNA(mtDNA)是位于线粒体内裸露的双链环状DNA分子，通常每个线粒体含有2～10个拷贝[1]。人类mtDNA全长16.6 Kb，含37个基因，分别编码13个蛋白、22个线粒体tRNA和2个线粒体rRNA。线粒体功能的实现依赖于mtDNA基因复制、转录[2]，因而细胞内mtDNA数量变化必然引起线粒体功能的改变。线粒体是氧化磷酸化反应的中心，可产生大量自由基，对mtDNA造成损伤；加之mtDNA缺乏核DNA所具有的组蛋白保护及完备的DNA损伤修复机制，因而比基因组DNA更易受到损伤。损伤的mtDNA通过自噬途径降解，细胞内mtDNA总数量减少，从而影响线粒体功能[3-5]。

细胞内及循环mtDNA拷贝数的变化与人类多种疾病相关，包括糖尿病及其并发症[6]、肥胖[7]、肿瘤[8]、HIV感染[9,10]等。此外，mtDNA拷贝数变化也与生长发育[11]、生育[12]、老年化[13]、环境变化[14]和体育锻炼[15]相关。然而，mtDNA拷贝数变化能否反映肾脏细胞的损伤、成为肾脏疾病的生物标志分子，目前尚无此类研究。为解决这些问题，我们首先尝试建立一种精确、稳定和经济地测定mtDNA拷贝数的方法。

目前，文献中测定mtDNA拷贝数的方法主要是Taqman探针法实时(Real-time)PCR[16]。但是，Taqman探针价格昂贵，不适宜高通量检测。与Taqman探针相比，SYBR Green Ⅰ 染料法成本低廉，使用简便，适宜大批样本检测。为此，本研究旨在建立mtDNA拷贝数的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR方法，并探讨其在肾脏疾病诊断及足细胞损伤检测中的应用。

材料与方法

主要试剂和仪器DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen)，Nco Ⅰ限制性内切酶(NEB)，引……