柳中洋，齐莹，郭鑫，蒋树娟，黄郁晶，邵耀中，阮强

（中国医科大学附属盛京医院病毒研究室，沈阳110004）

·论著·

人巨细胞病毒微小RNA miR⁃UL70⁃5P靶向抑制人即刻早期反应蛋白3的表达

柳中洋，齐莹，郭鑫，蒋树娟，黄郁晶，邵耀中，阮强

（中国医科大学附属盛京医院病毒研究室，沈阳110004）

目的寻找人巨细胞病毒微小RNA miR⁃UL70⁃5P调控的靶mRNA，检测miR⁃UL70⁃5P对靶mRNA蛋白质表达的调节作用。方法采用Hybrid⁃PCR方法从人巨细胞病毒感染的人胚肺成纤维细胞总RNA中筛选候选靶mRNA；采用荧光素酶实验验证miR⁃UL70⁃5p与候选靶mRNA的结合能力；采用Western blot方法检测转染miR⁃UL70⁃5P对部分靶mRNA蛋白质表达的调节作用。结果筛选并鉴定了人即刻早期反应蛋白3（IER3）等7种靶mRNA可与miR⁃UL70⁃5P特异性结合；在293T细胞中过表达的IER3可以被转染的miR⁃UL70⁃5P下调30%。结论人巨细胞病毒表达的miR⁃UL70⁃5P在病毒感染宿主过程中具备抑制IER3蛋白质表达的能力。

人巨细胞病毒；微小RNAs；人即刻早期反应蛋白3

微小RNAs（microRNAs，miRNAs）是一类长度为22个碱基的核糖核酸，虽然不能够翻译表达蛋白质，但可以通过与信使RNA反向互补结合，阻碍其翻译过程［1］。现已发现miRNAs在生命活动的各个方面发挥着精细的调节作用［2］。miRNAs在病毒中也有表达。人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）是人群感染率高达90%以上的DNA病毒。依据miRBase提供的资料，目前已经发现HCMV表达包括miR⁃UL70⁃5P在内的26种miRNAs。但是，miR⁃UL70⁃5P的生物学功能目前尚不清楚。本研究拟寻找HCMV miR⁃UL70⁃5P调控的靶mRNA，检测miR⁃UL70⁃5P对靶mRNA蛋白质表达的调节作用。

1 材料与方法

1.1 材料

HCMV H株（本实验室保存的临床分离株）；人胚肺成纤维细胞（human embryonic lung fibroblasts，HELF）（中国科学院上海细胞所）。pcr2.1载体（invi⁃trogen公司，美国）；Top10感受态细菌（北京天根生化科技有限公司）；荧光素酶报告质粒（appliedbio⁃systems公司，美国）；荧光素酶活性检测试剂（Pro⁃mega公司，美国）；pBI⁃CMV2（Clontech公司，美国）；蛋白质提取和检测试剂（Thermo公司，美国）；抗体（Abcam公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 使用hybrid⁃PCR筛选miR⁃UL70⁃5P的候选靶mRNA：用含15%胎牛血清的MEM培养HELF，密度为100%时接种HCMV H株。部分细胞在接种病毒前1 h用终浓度为100 μg/mL的放线菌酮处理，接毒后24 h使用Trizol法提取HCMV感染即刻早期（IE）总RNA；未经过放线菌酮处理的细胞在接毒后72 h，用Trizol法提取HCMV感染晚期（L）总RNA。使用TaKaRa公司的3′Full RACE试剂盒中的oligodT引物及逆转录酶将mRNA反转录成cDNA。设计并使用miR⁃UL70⁃5P的反向互补序列“TCTGGRCGRG⁃GCCGRGRCGC（R=A/G）”作为上游引物，oligodT引入的通用引物“ACCGTCGTTCCACTAGTGATTT”作为下游引物，以cDNA为模板进行PCR扩增，引物由北京invitrogen公司合成。PCR产物经过纯化后（A9280，Promega公司，美国），用TA克隆的方法连接到pcr2.1载体。将连接产物转化到感受态细菌中，挑取阳性克隆进行DNA测序。测序结果经过NCBI的blast软件比对得到同源mRNA序列，作为备选的靶mRNA。

1.2.2 荧光素酶实验验证miR⁃UL70⁃5P与候选靶mRNA的结合能力：使用逆转录PCR方法扩增候选靶mRNA与miR⁃UL70⁃5p结合位点附近约300～500 bp左右的序列。在扩增引物的5′末端分别加入了BamHⅠ和HindⅢ酶切位点序列。纯化PCR产物，进行BamHⅠ和HindⅢ双酶切。将酶切产物连接到pMIR report载体上荧光素酶基因的3′非翻译区（3′UTR区）的相应位点，得到“pMIR⁃靶mRNA”表达载体。用含10%胎牛血清的DMEM培养293T细胞，采用lip2000共转染pMIR⁃靶mRNA、海肾荧光素酶质粒（TK）以及miR⁃UL70⁃5P的成熟体（锐博公司，广州）到293T细胞。每个候选靶mRNA做3个复孔。使用线虫的一种非特异性靶向miRNA作为阴性对照。使用pMIR空载体作为系统误差对照。贴壁细胞通过裂解释放荧光素酶（Dual⁃Luciferase® Reporter Assay E1960，Promega公司，美国），进行荧光素酶活性检测（LB9507，Berthhold Technologies公司，德国）。先检测每一样本的萤火虫荧光素酶荧光强度，后检测海肾荧光素酶荧光强度。用“萤火虫荧光素酶荧光值/海肾荧光素酶荧光值”得到消除了组内转染误差的终数据。以每个样本的3个复孔所测终数据的平均值进行对比分析。

1.2.3 Western blot分析miR⁃UL70⁃5P对候选靶mRNA蛋白质表达的调控作用：根据与HCMV感染相关性及实验可行性，选取人即刻早期反应蛋白3（immediate early response 3，IER3）进行Western blot实验分析。将IER3mRNA全序列构建到pBI⁃CMV2蛋白质表达载体中，得到pBI⁃CMV2⁃IER3表达载体。共转染pBI⁃CMV2⁃IER3和miR⁃UL70⁃5P成熟体至293T细胞中。使用线虫的一种非特异性靶向miRNA成熟体作为miRNA阴性对照，使用pBI⁃CMV2自身表达的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）作为组内对照消除转染误差。转染24 h后收集蛋白质（M⁃PER®Mammalian Protein Extrac⁃tion Reagent，PIERCE公司，美国）进行Western blot检测。依次使用兔源多克隆抗体（Abcam公司，英国）和山羊抗兔的二抗（中杉金桥公司，北京）进行反应。使用ChemiDoc™MP System（Biorad，美国）进行成像，使用仪器配套软件image lab进行实验结果灰度分析处理。

2 结果

2.1 Hybrid⁃PCR筛选结果（表1）

表1 Hybrid⁃PCR筛选获得的HCMV miR⁃UL70⁃5P候选靶mRNAsTab.1 Candidate target mRNAs of HCMV miR⁃UL70⁃5p obtained by Hybrid⁃PCR screening

共筛选获得10种miR⁃UL70⁃5P的候选靶mRNA序列，8种来源于宿主细胞，2种来源于HCMV。其中，NQO2是一种黄素蛋白，功能是催化氧化还原反应；PP150是HCMV重要的衣壳蛋白，具有免疫原性，可引起宿主的体液免疫应答；核糖体蛋白L35构成核糖体亚基，参与蛋白质的合成；HCMV UL70是DNA复制引发酶，与HCMV的基因组复制有关；IER3是即刻早期反应蛋白，在辐射、感染等条件下迅速提高表达量，参与应激反应，并参与细胞凋亡的调控。这些靶基因涉及到细胞凋亡、HCMV感染与复制、细胞能量代谢、生物大分子合成等。

2.2 荧光素酶实验检测结果

miR⁃UL70⁃5P的转染未造成PMIR空质粒萤火虫荧光素荧光强度发生明显改变（图1）。除RO⁃MO1外，含有其它候选靶mRNA 3′UTR序列质粒的相对荧光值均表现为下调，说明候选靶mRNA与miR⁃UL70⁃5P确实存在结合关系。

图1 荧光素酶实验检测结果Fig.1 Result of Luciferase assay

2.3 Western blot结果

与作为miRNA参照的线虫miRNA成熟体作用效果相比，载体内参照蛋白GFP的表达没有受到转染的miR⁃UL70⁃5P的影响；而载体中IER3的蛋白质表达量被miR⁃UL70⁃5P下调了36.4%（图2）。

图2 免疫印迹结果Fig.2 Result of Western blot

3 讨论

HCMV的miRNA编码区分散于病毒整个基因组中。已经进行功能研究的miRNA包括miR⁃UL112［3～7］、miR⁃UL148D［8］、miR⁃US4⁃5P［9］、miR⁃US5⁃1［10］、miR⁃US5⁃2［10］、miR⁃US25⁃1［11］、miR⁃US25⁃2⁃3P［12］和miR⁃US33［13］等。它们的主要功能在于影响病毒复制，为病毒建立免疫逃避和潜伏感染状态创造有利条件。

Hybrid⁃PCR方法是本课题组建立的筛选miRNA靶mRNA的研究方法［14］，具有快速、灵活等优点。用此方法可以对特定组织细胞、特定时间的mRNA样本进行筛选。本研究中，对HCMV感染HELF细胞的即刻早期及晚期RNA进行了miR⁃UL70⁃5P候选靶mRNA的筛选，得到的靶mRNA来源包括宿主和病毒自身基因组，靶mRNA编码蛋白质的功能涉及到能量代谢、细胞凋亡、病毒复制、病毒衣壳形成等各个方面，提示miR⁃UL70⁃5P可能通过以上相关机制影响病毒的感染状态。

本研究只对HELF中miR⁃UL70⁃5p的靶mRNA进行了检测。因为组织分化的原因，某些蛋白质在肺组织中并不表达，所以本研究结果只能反映肺组织受到HCMV感染时miR⁃UL70⁃5P与宿主及病毒自身基因相互作用的情况。在HCMV敏感的其它组织细胞中进行hybrid⁃PCR的筛选，将有利于揭示miR⁃UL70⁃5P在特定组织细胞中对HCMV感染调控的机理。

本研究对初筛得到的所有10个候选靶mRNA进行了荧光素酶实验检测。不同的靶mRNA与miR⁃UL70⁃5p的结合能力并不相同。一般来说，miRNA与靶mRNA结合的自由能越高，miRNA发挥转录抑制的作用越显著，但是mRNA的三级空间结构和转录调控因子的空间占位效应可能会隐蔽起miRNA的结合位点，导致筛选得到的部分候选靶mRNA的3′UTR没有对荧光素酶表达产生影响。荧光素酶实验只可以验证miRNA与相应mRNA靶位点之间的结合性，并不能反映其与完整靶mRNA发生的相互作用。使用Western blot实验进行蛋白质水平的检测来验证miRNA对靶mRNA的转录后调控作用十分必要。

靶mRNA IER3编码产物是一种即刻早期反应蛋白质，在感染、辐射、缺血等应激状态下，表达值可以在15 min内迅速升高。研究发现，IER3蛋白在凋亡—抗凋亡过程中发挥双向作用。在培养条件恶劣的情况下，高表达的IER3可促进细胞凋亡发生；而在培养条件优越的情况下，IER3则可抑制凋亡［15］。本研究通过Western blot方法证实了miR⁃UL70⁃5P对IER3蛋白质表达具有明显的抑制作用。推测在HCMV感染肺组织过程中，miR⁃UL70⁃5P可能通过抑制病毒感染引起的IER3蛋白质表达来阻碍其诱导感染细胞的调亡，创造有利于病毒复制的微环境，从而确保病毒在宿主体内生存。

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（编辑 王又冬）

Human Cytomegalovirus microRNA miR⁃UL70⁃5P Suppresses the Expression of Immediate Early Response 3

LIU Zhong⁃yang，QI Ying，GUO Xin，JIANG Shu⁃juan，HUANG Yu⁃jing，SHAO Yao⁃zhong，RUAN Qiang
（Virus Laboratory，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo find the target message RNAs（mRNAs）of human cytomegalovirus（HCMV）microRNA（miRNA）miR⁃UL70⁃5P，and to detect regulation effects of miR⁃UL70⁃5p on protein expression of these target mRNAs.MethodsHybrid⁃PCR was used to screen the poten⁃tial target mRNAs in the pool of human embryo lung fibroblast（HELF）total RNAs.Luciferase report assay was used to identify the specific banding of miR⁃UL70⁃5P to the target mRNAs.Western blot was performed to validate the regulation effects of miR⁃UL70⁃5P on the protein expression of the target mRNAs.ResultsSeven mRNAs，including immediate early response 3（IER3），were identified as the targets of miR⁃UL70⁃5P.Over⁃ex⁃pressed IER3 in 293T cells could be down⁃regulated up to 30%by co⁃transfection of miR⁃UL70⁃5P.ConclusionHCMV miR⁃UL70⁃5p can sup⁃press the protein expression of its target mRNA，IER3，during infection.

cytomegalovirus；microRNAs；immediate early response 3

R373.9

A

0258-4646（2014）07-0577-04

国家自然科学基金（81171580）；教育部高等学校博士学科点专项科研基金（20112104110012）

柳中洋（1985-），男，研究实习员，硕士.

阮强，E-mail：ruanq@sj⁃hospital.org

2014-04-14

网络出版时间：