张颖颖，车 萍

（山东中医药大学，山东 济南 250014）

在中医院校，医学微生物学是一门重要的基础课程。该课程实验性强，实验学时较多。而菌种管理是一项基础工作，包括菌种的购买、活化、分离、保藏等环节，决定着医学微生物实验的成功与否。微生物实验室必须保证实验用菌种具有较高的纯度，稳定的生理生化特性，保证菌种在使用中不出现退化、死亡等现象，否则就会影响实验结果[1]。因此，需要制定严格的菌种使用管理规定，针对不同实验要求，选择合适的菌种，因地制宜采取最合适的菌种纯化保藏方法。笔者结合实验准备经验，就中医院校医学微生物实验菌种管理工作谈一下心得体会。

1 中医院校医学微生物实验常用菌种及其用途

中医院校医学微生物课程相对西医院校而言比较简炼，学时少，但教学内容覆盖面较广，还要与中医相结合，因此，其教学侧重中药抑菌、中医药抗病毒等方面。具体到菌种的选择上，革兰氏阳性细菌有金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、A群链球菌、枯草芽胞杆菌、肺炎链球菌、破伤风梭菌、结核分枝杆菌、藤黄微球菌等；革兰氏阴性细菌有大肠埃希菌、志贺菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、伤寒沙门菌、肖氏副伤寒沙门菌、变形杆菌、产气杆菌、霍乱弧菌等；真菌如白色假丝酵母等。以上菌种可用于细菌的各种染色法、接种法练习，观察各种微生物形态，进行中药抑菌实验等。

2 中医院校医学微生物实验菌种来源

2.1 直接采购

2.1.1 国内采购 目前国内各大菌种保藏机构均提供菌种采购服务，可按照其网站介绍进行购买，往往以安瓶等形式提供菌种。国内几大菌种保藏机构，如中国普通微生物菌种保藏管理中心、中国微生物菌保藏管理委员会普通微生物中心、中国工业微生物菌种保藏管理中心等，均出售菌种；另有各生物公司均提供进口与国产菌种服务；一般省级防疫中心也提供菌种服务。

2.1.2 国外采购 国外方面，如ATCC（American Type Culture Collection，美国典型菌种保藏中心）、NBRC（NITE Biological Resource Center，日本技术评价研究所生物资源中心）、DSMZ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，德国微生物菌种保藏中心）、CBS（Centraalbureauvoor Schimmelcul-tures，荷兰微生物菌种保藏中心）等都提供菌种服务，但其缺点在于价格昂贵、邮寄繁琐、耗时较长，因此不适用于学生实验。

2.2 自行分离

订购标准菌种简单方便，但也存在价格较高、程序繁琐等问题，如ATCC菌种价格通常为800元以上，国内菌种亦不低于200元。再者，若进行临床相关微生物研究，就必须准备临床分离菌种。因此，在微生物实验中，自行分离也是菌种的重要来源之一。如可从空气中分离葡萄球菌、藤黄微球菌，自口腔分离白色假丝酵母，从肠道中分离大肠埃希菌及其他肠杆菌等。在教学中，我们结合SRT（大学生研究训练）项目等学生活动，从环境中分离了藤黄微球菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌等常见菌种，既可用于实验教学，也可培养学生的动手能力。

2.3 从医院获得临床菌株

中医院校通常与相关医院有密切联系。临床病患体内外分离的菌株具有典型的致病性，便于结合临床进行教学，故此亦可成为菌种的重要来源之一。我校微生物教研室现有几十株从临床分离的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌（含MRSA等耐药菌株）、铜绿假单胞菌、痢疾志贺菌、福氏志贺菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌等临床菌株。但该法获得的菌株一般毒性较强，通常仅限于科研应用，在实验教学中使用时需注意生物安全，保存条件应符合相关规定。

2.4 致函索要

可在网络上检索相关文章，通过致函菌种拥有者索要菌株。国外众多科研机构可免费分享自己的菌种，有些需要签署保密协议，不得用于商业用途等。该法多用于科研。

3 实验菌种的复活、传代、纯化工作

3.1 外购菌种

若采用外购菌种，复活和传代是必备的基本操作。可以将适量液体培养基滴入安瓿瓶中，溶解菌种并接种于对应培养基上，在适宜条件下进行培养，经形态学、生化反应等鉴定为纯种后方可投入实验应用。在此过程中必须保证菌种的纯度及性状稳定，如发现污染或菌种不纯，则应通过划线分离操作将其进一步纯化，重新分离挑选纯菌落[2]。

3.2 自行分离菌种

自行分离菌种时，复活步骤无需考虑，重在菌种的鉴定、纯化、传代和保藏。其中鉴定工作可查阅相关资料，如《伯杰氏细菌手册》等权威工具书，根据形态学特征、生化反应及免疫学检验等确定菌株，并通过选择培养基和划线分离等手段进行纯化。各项指标均应符合规定，以保证菌株鉴定的准确性。

4 实验菌种常用保藏方法

由于条件所限，中医院校在实验设备上往往与西医院校有一定差距，因此，如何针对实际情况采取合适的菌种保藏方法，也是需要重点思考的问题。常用菌种保藏方法有6类，分别是定期移植保藏法、液体石蜡覆盖保藏法、试管熔封保藏法（试管密封法）、干燥法、冷冻真空干燥法和液氮超低温保藏法。在此，笔者结合实际条件，在充分查阅文献的基础上选取了几种常用且简单易行的保藏法，并做了适当改进，收到了较好效果，现介绍如下。

4.1 定期移植保藏法

学生实验中大量使用的菌种一般使用该法保藏。具体操作为斜面低温保藏，即以无菌操作将菌种转种于新鲜培养基斜面上，经鉴定菌种纯度及生理生化性状符合要求后置于4～6℃冰箱中低温保存。此法适用于要求不高，但菌种需求量较大的革兰氏染色、细菌接种、药物敏感实验等。

4.2 液体石蜡覆盖保藏法

该法是一种改良的传代培养方法，通常将菌种接种于适宜的培养基上，取培养后生长良好的斜面，加入无菌石蜡油没过培养基最上端约1 cm，包裹牛皮纸后将其放置于4℃冰箱低温保存。外购菌种经该法转种保藏后可保证1～2年内菌种性状不变。因此，该法适用于普通微生物实验室菌种保藏。近年来我校购进菌种部分为试管斜面保存，故我们在实践中广泛采用该法对菌种进行保存，收到了较好效果，可保证1年内菌种的性状稳定。

4.3 动物组织保藏法

王丹敏[3]等用含菌鼠肝保存肺炎链球菌取得成功。因此可用含菌动物组织于-20℃环境下进行菌种保存，其保藏时间可达18～20个月。经实践验证，该法对某些抵抗力较弱的致病性细菌有效。

5 总结

做好医学微生物实验菌种管理工作，必须制定严格的操作程序，完善相关制度，实施规范操作，不断总结经验以提高管理水平。

5.1 严格菌种管理制度，尽可能购买高质量菌种

国内外各机构、公司均可提供菌种服务，但质量不尽相同。如ATCC标准菌种虽价格较贵，但质量稳定，用于要求较高的科研实验较为合适；国标CMCC菌株经济性较好，质量也有保证，亦是较好的选择；也有个别公司提供的菌种存在污染等现象，笔者在工作中曾遇到此类情况，后通过分离纯化保证了实验的正常进行。科研工作中如需临床分离的非标准菌种，则可向国外同行致函索要，往往能得到满意的结果。

5.2 注重生物安全，做好高致病性菌种保管工作

医学微生物实验对操作要求较高，要求实验室建立完整严格的管理规范，做好菌种管理工作。由专人负责，使用时严格无菌操作，防止菌种污染。此外还要按照正确的方法进行菌种传代保藏，以免菌种退化。

5.3 从实际出发，根据实验室条件制定合适的保藏策略

菌种保藏方法多样，对实验条件要求各不相同，通常越复杂的方法保藏效果越好。本文所述之法均简单易行，一般条件的微生物实验室均能满足，且经实践证明完全能满足中医院校医学微生物学教学要求。如需进行深入研究，则可视情况采用较为复杂的保藏法。

总之，在中医院校，完善的菌种管理是医学微生物学教学科研工作顺利开展的前提。微生物实验室应尽可能做好菌种库建设工作，既要有常用标准菌株，也应收集部分临床菌株，保证满足教学科研需求。这就要求我们在工作中注重菌种收集，因地制宜采用最合适的保藏法，注重经济性与实用性的结合，有效提高菌种的使用效率。同时，近年来生物安全的重要性日益凸显，为保证菌种的安全使用，必须建立健全管理制度，严格消毒灭菌程序，防止出现安全事故。