田贵金，唐瑞峰，孙 超，苑建磊，齐 帅，李智峰

(1.河北医科大学第四医院肝胆外科，河北 石家庄 050011；2.河北省邯郸市第一医院普外三科，河北 邯郸 056002)

原发性肝癌恶性度高，预后差是因为肿瘤具有强大的生长和转移能力，而癌细胞的浸润和远处转移与血管内皮生长因子B(vascular endothelial growth factor B，VEGF-B)密切相关。其通过诱导肿瘤周围血管新生，促进癌细胞血行转移。VEGF-B的表达受多种细胞因子的调节，其中细胞因子白细胞介素(interleukin，IL)2、6可以通过影响细胞活动力、肿瘤细胞的增殖、肿瘤特异性抗原的表达从而影响肿瘤的进展，也可以通过调节VEGF-B的表达来影响肿瘤的生物学特性。本研究分析IL-2及IL-6对人肝癌细胞表达VEGF- B的调节，旨在为肝癌的治疗提供实验基础。

1 资料与方法

1.1 细胞培养、刺激及总RNA的提取：在37℃、5%CO2的饱和湿度的无菌培养箱中应用RPMI 1640培养基(含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素)培养人肝癌细胞株SMMC-7721及BEL-7402。细胞呈稳定对数生长后，更换浓度为0.1%胎牛血清RPMI 1640培养基继续培养12h，以消除血清对细胞增殖的影响。然后分别应用含有0.1、1、10、100、200μg/L的IL-2或IL-6的0.1%胎牛血清的培养基作为实验组，分别培养3、6、12、24h，对照组中加入等剂量的磷酸钠盐缓冲液培养，定时收取细胞后以Trizol一步法提取刺激前后总RNA。

1.2 RT-PCR：取总RNA 2μL，加入AMV逆转录酶及逆转录反应物，42℃、反应60min；取所得单链cDNA 2μL，加入VEGF-B正义引物2.5μ、反义引物2.5μL、PCR反应物13μL，使总反应体系为20μL，94℃、3min预变性，95℃、45s变性，57℃、45s退火，72℃、1min延伸，共扩增35个循环后72℃、5min再次延伸。同法，取所得cDNA 2μL，加入GAPDH正义引物2.5μL、反义引物2.5μL、PCR反应物13μL，使总反应体系为20μL，预变性条件95℃、3min，变性条件94℃、30s，57℃、30s退火，72℃、 30s延伸，共扩增35个循环后72℃再次延伸5min。……