易亚乔 ,肖碧跃 ,刘英飞 ,刘 林 ,陈 懿 ,廖 君 ,葛金文

(1.湖南中医药大学仲景学说教研室,湖南长沙410208;2.益阳医学高等专科学校附属医院神经内科;3.湖南中医药大学中西医结合基础重点学科)

血管性痴呆(Vascular dementia,VD)是迄今为止唯一可防治的痴呆,如早期治疗会具有可逆性。关于VD的发病机制目前尚不十分清楚,多数学者认为,VD的发病机制主要与脑血管病变导致局部或全脑缺血或缺氧后引起脑部与认知、记忆等相关的特定神经组织损害有关[1-3],因而对于一般VD而言,存在一般性脑缺血缺氧的病理生理改变。短暂性脑缺血或缺血后再灌注最易损伤海马,导致代谢异常,诱发神经元死亡,引起永久性脑组织损伤[4]。NR2A和NR2B是分布于海马的N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-Methyl-D-Aspartate Receptor,NMDAR)的主要调节亚单位,NR2A基因敲除明显降低海马CA1区 NMDA受体电流和 LTP,损害空间学习能力,NR2B基因敲除后小鼠记忆能力下降,而移植转染NR2B基因细胞可使大鼠记忆明显增高[5-7]。目前已有研究证实血管性痴呆(VaD)引起大鼠学习记忆能力下降,NR2A、NR2B在CA1区的表达水平下降,但是关于加味脑泰方对血管性痴呆的作用鲜有报道。本实验通过建立大鼠四血管阻断法制备血管性痴呆模型,然后服用加味脑泰方,观察加味脑泰方对血管性痴呆大鼠学习记忆和海马区NR2A及NR2B表达的影响,探讨加味脑泰方在治疗血管性痴呆中的可能作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验仪器和试剂

兔抗NR2A抗体(Abcom公司)、兔抗NR2B抗体 (Sigma公司),3,3-Diaminobenzidine(DAB)(Vector公司),生物素化广谱(Vector公司),MT-200Morris水迷宫(成都泰盟科技有限公司),IgG O-lympus E53显微镜(Olympus公司)。

1.2 药物制备

加味脑泰方煎剂浓缩液的制备：该方由黄芪、益智仁、石菖蒲、田七、葛根、地龙、川芎组成。饮片由湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供。购回后置入容器内加自来水(量为药材量5倍)浸泡2 h,煮沸后再以微火煎煮30 min,过滤取汁得头煎。药渣再加3倍水煎煮20 min,过滤取汁得二煎,两煎混合,于水浴上浓缩至100%浓度(每毫升药液相当于生药1 g),置4℃冰箱中保存备用。

1.3 实验动物及分组

36只SD大鼠,健康清洁级,3月龄,体重342.7±25.8 g(湖南省长沙市东创实验动物中心提供)。所有实验动物饲养于湖南中医药大学实验动物部,室温保持22℃,相对湿度55%,饲养于12-12 h光暗环境,给予标准饮食和自由饮水。所有SD大鼠随机分成假手术组、模型组以及加味脑泰方组,每组12只。模型制备过程尽量减少大鼠的痛苦和应激。

1.4 实验方法

1.4.1 实验动物模型的建立 假手术组(Sham group)：模型动物只做皮肤切口和组织分离处理,不进行椎动脉烧灼和颈总动脉夹闭,术后大鼠保温。模型组(Vehicle group)：模型的建立如Schmidt-Kastner等[8]人所描述：将大鼠行背侧颈正中切口,逐层钝性分离暴露双侧第一颈椎横突翼小孔,用直径0.5 mm的电凝针烧灼双侧翼小孔内的椎动脉,造成永久性闭塞。24 h后再将大鼠麻醉,行腹侧颈正中切口,钝性分离双侧颈总动脉,用微动脉夹夹闭双侧颈总动脉5 min,共3次,每次间隔1 h。模型制备成功后不给任何干预。加味脑泰方组(SNTF group)：造模成功后开始每天给药5 g/kg,每日1次,连续灌胃给药30天。

1.4.2 行为学检测 3个组别在造模成功30天后进行水迷宫实验检测学习记忆。采用MT-200Morris水迷宫视频跟踪系统。水迷宫为圆形不锈钢水池,水池直径为120 cm,高60 cm。池壁上标有四个不同符号,将水池等分为4个象限,表示4个入水点。目标象限的中央放置高为50 cm,直径10 cm的圆形隐藏平台,平台低于水面1 cm,水温保持在(22±0.5)℃。预先在水池中注入清水,加入碳素墨水使池水变为不透明的黑色以隐藏平台并便于摄像。迷宫上方安置带有显示系统的摄像机,计算机自动跟踪计时并同步记录大鼠的游泳轨迹,Morris水迷宫数据采集和分析软件记录相关数据及图象结果。整个实验期间水池、光源等外部条件保持不变。

定位航行试验(place navigation)：检测大鼠对水迷宫学习记忆的获取能力。大鼠先适应训练1天,剔除明显异常者。大鼠连续接受5天训练,每天将大鼠面向池壁分别从4个入水点放入水中,每次实验以120 s为限,记录动物寻找并爬上平台所需时间即逃避潜伏期(escape latency,EL),以爬上平台所需时间作为学习和记忆成绩。如在120 s内未找到平台,计算机停止跟踪,将未找到平台的动物由操作者将其引上平台停留30 s。每天训练完成后,迅速将动物用布擦干,置于加热器旁。计算每天各组大鼠4次逃避潜伏期的平均值。

空间探索试验(spatial probe)：测量大鼠学会寻找平台后,对平台空间位置的记忆保持能力。在定位航行试验后(即水迷宫的第6天)撤去平台,然后任选一个固定象限作为入水点将大鼠面向池壁放入水中,记录其120 s内的游泳轨迹及穿越原平台位置的次数。

1.4.3 脑组织标本的制备 服用加味脑泰方30天后,灌注取材3组SD大鼠。过量10%水合氯醛腹腔注射麻醉,待麻醉成功后,使用0.9%生理盐水快速灌注,然后改用4%多聚甲醛溶液快速灌注,快速灌注一段时间后,然后慢灌。取出脑组织后固定过夜、沉糖(过30%糖2遍)和包埋。采用邻切法,切片厚度为30 μm。

1.4.4 免疫组织化学染色 NR2A、NR2B免疫组织化学染色的实验步骤主要如下：当天切好组织后,0.01 mol/L PBS+0.1%tritonX-100缓冲液(pH=7.3)漂洗3次,每次10 min;3%H2O2处理30 min,然后漂洗3次,方法如上;5%马血清孵育2 h,然后加入一抗(NR2A、NR2B的抗体浓度依次为1:200、1:500),4℃冰箱过夜;第二天拿出组织复温(26±0.5)℃,漂洗3次,加入二抗(1:400)室温孵育2 h;ABC复合物：A液(卵白素)与B液(生物素)提前半小时配好,浓度比为1:400,室温孵育2 h;DAB显色：显微镜下控制组织显色时间;梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树脂封片。

1.5 免疫组织化学染色结果分析

3组脑片在同等曝光值和像素下使用Olympus E53显微镜拍照,应用Image pro plus 6.0图像分析软件检测3组相同部位等面积下细胞光密度值。以上所有实验数据以均数±标准差表示,通过单因素方差分析(One-way ANOVA)统计不同组间差异。实验结果采用Prism GraphPad5.0统计软件进行统计分析和处理。以α=0.05为检验水准,P＜0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 定位航行试验和空间探索试验

在定位航行试验中,以训练的最后一天计算成绩(第5天)。假手术组、模型组、加味脑泰方组的逃避潜伏期(EL)分别为18.7±5.4、64.4±10.1、27.4±6.5 s,假手术组、加味脑泰方组与模型组比较,差异均有显著性(t=11.28,t=9.13,表1)。水迷宫试验第6天进行空间探索实验,假手术组、模型组、加味脑泰方组的穿越平台次数分别为9.1±1.30、5.6±0.80、8.1±0.98次,假手术组、加味脑泰方组与模型组比较,差异均有显著性(t=6.43,t=4.63,表 1)。

表1 三组逃避潜伏期和穿越平台次数的比较

2.2 CAl区NMDA受体NR2A、NR2B在3个组别的表达

NR2A+细胞在假手术组、模型组、加味脑泰方组分别为26.9±4.7、14.8±3.3、22.4±2.6个;假手术组、加味脑泰方组分别与模型组比较,差异均有显著性(t=6.16,t=3.88,P＜0.01)。NR2B+细胞在假手术组、模型组、加味脑泰方组分别为23.9±6.2、12.6±2.9、18.9±3.0 个;假手术组、加味脑泰方组分别与模型组比较,差异均有显著性(t=4.89,t=2.72,P＜0.01)。NR2A+细胞单位面积的平均光密度值假手术组、模型组、加味脑泰方组分别为0.45±0.06、0.30±0.03、0.41±0.04 mm2;假手术组、加味脑泰方组分别与模型组比较,差异均有显著性(t=4.78,t=6.69,P＜0.01)。NR2B+细胞单位面积的平均光密度值假手术组、模型组、加味脑泰方组分别为 0.43±0.04、0.24±0.03、0.34±0.04 mm2;假手术组、加味脑泰方组与模型组比较,差异均有显著性(t=9.15,t=4.81,P＜0.01),见表2。

3 讨 论

血管性痴呆(VaD)好发于老年人中风之后,是老年人常见的痴呆[9]。血管性痴呆相当于祖国医学“呆疾”、“文痴”、“善忘”等病症,其病位在脑,属本虚标实之症,以正气亏虚为本,瘀痰浊毒为标,气虚是其病理基础,病因以痰瘀多见,气血亏虚,痰瘀阻络为其常见病机。加味脑泰方是在中医药理论指导下,以《医林改错》中的“补阳还五汤”为基础方,结合临床用药经验加减而成,由黄芪、益智仁、石菖蒲、田七、葛根、地龙、川芎组成。方中黄芪其力专、性走,周行全身,大补脾胃元气,令气旺则血活,血活则瘀除,益智仁有温脾温肾益智之功,两药为君以治其本;豁痰开窍之石菖蒲,活血祛瘀之田七为臣药;行气活血的川芎,通经活络的地龙,升阳、解肌的葛根为佐药,诸味配合,共奏理气活血、豁痰开窍、益智醒神之效。前期研究应用益气活血、祛痰通络的脑泰方治疗中风有良好的临床效果[10]。本研究前期的实验也表明脑泰方能促进大鼠缺血脑组织血管新生[11]。

表2 三组NR2A+,NR2B+以及它们平均光密度值的比较

海马参与大脑的学习和记忆活动,是脑边缘系统的一个重要组成部分,NR2A和NR2B是NMDA主要调节亚单位,NR2和NR1聚合形成功能性复合物形成功能性受体,表现出活性。NMDA受体构成的变化引起NMDA受体活性改变从而导致学习与记忆改变。本研究发现,与假手术组相比,NMDA受体调节亚型(NR2A和NR2B)在血管性痴呆大鼠海马各区的表达水平都呈下降的趋势,学习记忆能力也下降(P＜0.0001)。这可能是加味脑泰方通过调控NR2A,NR2B在海马的表达而提高血管性痴呆大鼠的学习记忆,与Olivares D[12]、赵晖[13]以及李君等[14]人报道的结果相一致。关于加味脑泰方干预后VaD大鼠海马组织NR2A,NR2B及mRNA表达情况以及长时程增强(LTP)的变化将在以后的实验中进一步研究和阐述。

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