(南华大学病原生物学研究所,湖南衡阳421001)

支原体是一类能引起人类呼吸道和泌尿生殖道感染的病原体[1]。目前其致病机制尚未完全明了,但其诱导的异常免疫反应是导致机体免疫损伤的重要因素[2]。由于支原体缺乏细胞壁,其细胞膜是支原体与宿主细胞相互作用的唯一结构,其膜脂蛋白是引起炎症反应的主要物质。支原体脂蛋白和其他细菌脂蛋白结构类似,由N端的二酰半胱氨酸以及C端的多肽组成,其中N端的二酰半胱氨酸结构是其免疫活性的基础[2]。由于支原体脂蛋白在提取过程中易被内毒素污染,因此在研究其功能时,通常采用与脂蛋白结构相同的人工合成的巨噬细胞活性脂肽-2(macrophage-activating lipopeptide-2,MALP-2)作为替代物质[3]。研究显示,MALP-2通过与细胞表面的TLR结合后,能激活MAPKs以及核转录因子NF-κB和AP-1,从而诱导多种前炎症细胞因子和介质的表达[4]。既然支原体感染所诱发的炎症反应是其主要的致病因素,对机体而言,必然存在某种负调控机制使炎症反应趋向于稳态,从而避免组织损伤。研究发现,在感染状态下,机体可合成多种保护性蛋白,包括谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基,NAD(P)H:醌氧化还原酶1(NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1,NQO1)以及血红素氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)等。但MALP-2是否也能诱导这些抗氧化相关蛋白的表达,目前仍不清楚。本研究旨在观察MALP-2对HO-1和NQO1表达的影响并探讨其调控机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料

人单核细胞系THP-1细胞购自ATCC,MALP-2购自Alexis Biochemicals(ALX-162-027-C050)。鼠抗人HO-1、NQO1、p-Akt及 total Akt抗体购自 Cell Signaling。LY294002购自 Sigma-Adrich。鼠抗人Nrf2抗体购自Santa Cruz。Nrf2 siRNA序列由Ribo-Bio公司合成。凝胶迁移率分析试剂盒购自Viagene。蛋白酶、磷酸酶抑制剂Cocktail购自Roche,细胞蛋白提取试剂盒、蛋白浓度测定试剂盒购自Thermo,FuGENE6转染试剂购自Roche。

1.2 细胞培养与处理

THP-1细胞用含10%FBS、2 mmol/L谷氨酰氨、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基中,于37℃ 5%CO2的恒温细胞培养箱中培养。MALP-2刺激前,THP-1细胞于1 000 rpm离心5 min,无菌 PBS洗涤后,用含1%FBS的RPMI-1640培养液于6孔板中调整其密度为5×105/mL,37℃ 5%CO2继续培养24 h。根据不同的实验目的分为阴性对照组和实验组。其中对照组仅加入等体积培养基,而实验组根据不同的研究目的加入不同浓度MALP-2刺激5～120 min或12 h。

1.3 Western blot检测HO-1、NQO1表达及Akt磷酸化

细胞刺激结束后,用预冷的无菌PBS洗涤,迅速置于冰上,按照胞浆/胞核蛋白提取试剂盒提供的步骤获取胞浆蛋白或总蛋白,BCA法测定其浓度。取80 μg蛋白加入等体积的2×SDS上样缓冲液煮沸5 min后用于SDS-PAGE。随后转印至PVDF膜上。并利用含5%脱脂牛奶的TBST封闭1 h,随后加入一抗抗体4℃孵育过夜。多次洗涤后,加入HRP标记的二抗孵育膜1 h。ECL法发光、显影。

1.4 凝胶迁移率实验检测Nrf2 DNA结合活性

THP-1细胞处理结束后,按照试剂盒提供的方法获取核蛋白。根据Viagene公司提供的非放射性EMSA试剂盒的操作步骤建立结合反应体系和竞争反应体,随后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。电转移后,交联固定DNA,化学发光显影。

1.5 免疫荧光观察Nrf2核转位

用PBS洗涤细胞并重悬,加入0.1～0.5 mL细胞悬液至载玻片上,用甩片机在1 200 rpm下离心10 min,室温干燥15～20 min。随后用3.5%多聚甲醛室温固定15 min,随后用100%甲醇通透10 min。PBS洗涤后,1%山羊血清37℃封闭30 min。加入Nrf2抗体(1:100)孵育2 h。用PBS充分洗涤后,加入羊抗鼠二抗(1:1 000)室温孵育1 h。细胞核采用1 μg/mL DAPI染色。随后采用共聚焦显微镜拍照(Zeiss LSM710)。

1.6 瞬时转染siRNA

约5×104细胞接种于24孔板中培养过夜。随后按照FuGENE6提供的操作步骤,将100 nmol/L Nrf2 siRNA(正义链5′-UCC CGU UUG UAG AUG ACA A-3′;反义链5′-UUG UCA UCU ACA AAC GGG A-3′)混合物孵育细胞。转染24 h后,用PBS漂洗细胞,并用1%FBS维持24 h后再用MALP-2刺激12 h。

1.7 统计学分析

应用GraphPad Prizm软件进行统计学分析,数据用±s表示,并采用单因素方差分析数据,P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 MALP-2诱导THP-1细胞表达HO-1和NQO1

Western blot结果显示,0.01 ng/mL MALP-2作用THP-1细胞12 h后,可明显诱导HO-1和NOQ1表达,且随MALP-2浓度增高,HO-1和NQO1表达逐渐增多(图1A、B)。其中5 ng/mL MALP-2处理后,HO-1和NQO1表达分别增加了3.2和4.4倍,而此时尚未出现细胞毒性作用(MTT结果未显示)。

图1 MALP-2诱导THP-1细胞表达HO-1和 NQO1蛋白 A、B：Western blot;C、D：灰度扫描(相对值).与对照组(0 ng/mL)比较,*：P＜0.05

2.2 MALP-2激活PI3K诱导HO-1和NQO1表达

5 ng/mL MALP-2作用THP-1细胞5 min即可诱导PI3K下游产物Akt磷酸化(图2)。而THP-1预先经不同浓度PI3K特异性抑制剂LY294002处理后,再用MALP-2刺激12 h,HO-1和NQO1表达随之降低(图2)。

2.3 MALP-2诱导Nrf2核转位

5 ng/mL MALP-2作用THP-1细胞60 min后,激光共聚焦显示,核转录因子Nrf2核转位明显增多。而经25 μmol/L PI3K特异性抑制剂LY294002处理后,可显著降低细胞核中Nrf2水平(图3)。

2.4 MALP-2增强THP-1细胞中Nrf2 DNA结合活性

5 ng/mL MALP-2处理30 min尚不能检测出Nrf2 DNA结合活性的变化,60 min后开始增强,120 min后达到高峰。未标记Nrf2探针可使DNA-蛋白结合形成的滞后条带消失,而NF-κB探针对其无明显影响。同时,Nrf2抗体结合后,能形成一条超滞后条带(super shift)。LY294002处理后,DNA结合活性降低(图4)。

图2 MALP-2经PI3K诱导THP-1表达HO-1和NQO1

2.5 Nrf2参与HO-1和NQO1的表达

采用Nrf2 siRNA干扰其表达后,Western blot结果显示,HO-1和NQO1的表达水平显著降低(图5)。

图3 MALP-2经PI3K诱导Nrf2核转位

图4 MALP-2经PI3K增强Nrf2 DNA结合活性 1：对照

3 讨 论

图5 Nrf2参与调控MALP-2诱导HO-1和NQO1表达

炎症是机体抵抗外源性感染的一种自我防御反应。对于机体而言,炎症反应必然受到受到严格的调控,从而使机体的炎症-抗炎反应趋于平衡而避免过度炎症反应的发生[5-6]。目前已经证实,机体可表达过多抗氧化、抗炎功能的蛋白,从而负调控炎症反应[7],其中以HO-1和NQO1研究最为透彻。研究显示,通过诱导HO-1高表达可显著降低细胞因子及炎症介质的含量,抑制粘蛋白表达以及细胞凋亡[8],同时,LPS也可上调HO-1和NQO1的表达,从而抑制IL-1β和TNF-α的过度分泌[9]。此外,采用药物诱导HO-1或NQO1表达后,可下调多种细胞因子以及炎症介质的表达[10]。这表明 HO-1和NQO1在维持机体的稳态方面发挥重要作用,这可能是机体一种获得性的自我保护机制。本研究证实,MALP-2可通过PI3K/Nrf2通路诱导THP-1细胞表达HO-1和NQO1,这表明支原体感染后,虽然能诱导单核、巨噬细胞产生炎症因子或介质清除病原体,但同时也能诱导HO-1和NQO1的表达,从而在一定程度上负调控炎症反应而避免炎症失控或组织损伤。PI3K是参与细胞生长以及骨架重塑的重要激酶,其激活后可导致脂质底物磷酸化而形成第二信使,并激活下游蛋白激酶 B,即Akt。因此检测Akt的磷酸化可间接反应PI3K的激活[11]。有研究显示TLR2和相应配体结合后,可与PI3K形成复合体而参与信号转导[12]。本研究证实MALP-2处理后能明显诱导 Akt磷酸化,而 PI3K抑制剂处理THP-1细胞后,HO-1和NQO1表达明显降低,这表明HO-1和NQO1的表达受PI3K的调控。Nrf2在正常情况下与抑制因子Keap1存在于细胞浆中,keap1降解后,Nrf2转位至细胞核内与 HO-1或NQO1基因上游的启动子趋于结合而诱导其表达[13-14]。本研究通过免疫荧光证实MALP-2能显著诱导Nrf2核转位,凝胶迁移率实验也进一步证实了其DNA结合活性显著增强,而上述过程能被PI3K抑制剂LY294002所抑制。同时,采用siRNA干扰Nrf2表达后,HO-1和NQO1的表达也随之降低。这表明Nrf2和PI3K参与HO-1和NQO1的表达。

总之,本研究证实MALP-2可通过PI3K/Nrf2信号通路反馈性诱导HO-1和NQO1的表达,从而可能实现对炎症反应的负调控,这在维持机体的稳定具有重要意义。由于MALP-2是支原体膜蛋白的衍生脂肽,其主要的生物学特性是致炎作用。若能从结构上对MALP-2进行改造,降低其致炎活性而保留HO-1和NQO1的诱导活性,或许可以成为某些炎症性疾病治疗的重要辅助药物。

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