精子发生过程中调控性非编码RNAs的功能

2014-03-11郭文龙耿德海张建立张艳敏刘淑卓

医学研究与教育 2014年6期

王燕，郭文龙，耿德海，王波，张建立，张艳敏，刘淑卓

（1. 河北大学基础医学院, 河北保定 071000；2. 涞水县县医院，河北涞水074100；3. 易县县医院，河北易县074200；4. 易县中医院，河北易县 074200；5. 河北大学附属医院，河北保定 071000）

王燕1，郭文龙2，耿德海2，王波3，张建立3，张艳敏4，刘淑卓5

精子数量下降和质量减低是全球范围内男性不育疾病增加的主要原因。因此理解精子发生及其调控的分子机制是非常必要的。精子发生主要分为有丝分裂、减数分裂和精子形成三个阶段，这些过程被阶段特异性的基因表达严格调控，而众多的调控性非编码RNAs则是基因表达的重要调控因子。飞速发展的基因组检测技术已经证实，调控性非编码RNAs在不同生物演化和疾病进程中基因表达的转录和转录后水平上发挥重要的调控作用，其包括微小RNA(miRNA)、小干扰RNA（siRNA）、与PIWI蛋白相互作用的RNAs（piRNA）和长链非编码RNA（lncRNA）。讨论这些转录本在精子发生中的功能作用，并综述其异常表达与相关疾病的关系。

调控性非编码RNAs；精子发生；基因表达；男性不育

精子发生是一个高度复杂的分化过程，包括精原细胞的有丝分裂增殖、精母细胞的减数分裂和精细胞经过变态过程形成精子三个阶段。这一过程受多种表观遗传机制共同调控，其中调控性非编码RNAs的功能越来越得到人们的重视。占据人类基因组98.5%的非蛋白编码序列中，绝大多数被转录成调控性非编码RNAs，这些RNAs在多个层面上参与精子发生过程中基因表达的调控，并与男性不育等人类重大疾病密切相关。现综述精子发生过程中调控性非编码RNAs的作用机制，为男性不育的治疗提供理论基础。

1 miRNA与精子发生

miRNA为长度21～25个核苷酸不等的内源性非编码RNA。大多数小RNA基因首先在RNAPol II作用下先转录成初级miRNA，然后在RNase III酶Drosha和双链RNA绑定蛋白DGCR8组成的核微处理器复合体作用下形成70个核苷酸长度的miRNA前体，DGCR8可识别RNA底物，而Drosha则具有核酸内切酶的作用[1]。随后，miRNA前体物转运到胞质，被核酸内切酶Dicer进一步处理成21～25个核苷酸长度的成熟小双链miRNA。最后成熟的miRNA与AGO蛋白和其它辅助蛋白结合形成RNA诱发沉默复合体（miRNA-induced silencing complex，miRISC）[2]。通过miRISC、miRNA调节靶mRNA，使其降解或翻译抑制。精子发生过程中，miRNA调控机制在调节雄性生殖细胞分化过程中基因阶段特异性表达上具有重要作用。miRNA微阵列、RT-PCR或小RNA序列研究证实，miRNA高度、广泛、优先的表达在睾丸和雄性生殖细胞分化的各个阶段[3]。研究[4]发现，在精原干细胞、精原细胞、精母细胞和精子中可以表达几种相同的miRNA，但也有一些miRNA表达在某些特定的细胞类型中。如miR-34c既存在于精原干细胞中，调控其状态，又在精母细胞和圆形精子细胞中高度表达，在精子发生后期发挥重要作用[5]。

2 siRNA与精子发生

siRNA为长度21～28个核苷酸不等的内源性非编码RNA。与miRNA不同的是，siRNA源于长双链RNA，在生成过程中不需要核微处理器复合体的作用，而是直接在核酸内切酶Dicer的催化下形成成熟的siRNA。Song等[6]研究发现，siRNA在小鼠雄性生殖细胞中高度表达，睾丸RNA测序技术已经鉴别了73种siRNA，其中绝大多数分布在不同染色体的几个至几百个不同的位点上，这种分布情况表明其不仅可以调控转录后的RNA，也可影响核内染色质修饰。siRNA的作用靶点92%为mRNA，4%为非编码RNAs，3%为假基因的转录产物，1%为逆转录转座子[4]。siRNA诱发转录后基因沉默现象称为RNA干扰，此技术能有效抑制精子发生过程相关基因表达，进而研究这些基因的功能作用。精子发生早期，利用siRNA抑制Bcl6b、Ets相关分子和LIM同源框1的转录，发现精原干细胞的自我更新受到影响，表明这些转录因子是精原干细胞自我更新所需的关键因子[7]；利用siRNA沉默Gfra1基因，小鼠精原干细胞会从自我更新转而分化为A1-A4型精原细胞，表明Gfra1可抑制精子发生[8]；利用siRNA敲除Nodal基因，发现细胞凋亡增加，表明Nodal可抑制细胞凋亡[9]; 精子发生晚期，通过siRNA特异性敲除Slx和SlxL1基因，发现小鼠生育力明显下降[10]。在支持细胞中，利用siRNA敲除Pard6a或Part3基因，发现血睾屏障相关蛋白表达减少，表明其具有重建血睾屏障的作用[11]，此外siRNA还可抑制beta-1整联蛋白，导致支持细胞之间闭锁蛋白的再分配和血睾屏障的失衡，易诱发男性不育等相关疾病[12]。

3 piRNA与精子发生

2006年Aravin等[13]通过高通量测序技术发现了与PIWI蛋白互相作用的RNA，称为piRNA。这种RNA构成了调控性非编码RNAs的重要组成部分，在雄性生殖细胞中占主导地位。piRNA为24～30个核苷酸不等的单链RNA，其合成不需要核微处理器复合体和Dicer酶的催化。Jodar等[14]研究发现，哺乳动物中的piRNA成簇富集在基因组中，长度可达100 kb，广泛参与雄性生殖细胞发育、表观遗传调控和移动元件抑制等过程。精子发生过程中，piRNA可抑制移动转位因子的激活过程，其缺失可能诱发精子发生障碍[15]。piRNA的功能由其绑定的PIWI蛋白所调控，在大鼠中有三种PIWI亚家族成员，分别是PIWIL1/MIWI，PIWIL2/MILI和PIWIL4/MIWI2[16]。MILI主要存在于精原细胞到粗线期精母细胞阶段，MIWI则存在于粗线期精母细胞到圆形精子细胞阶段。任何一个PIWI蛋白异常都会影响精子发生过程，造成精子DNA损伤和生殖细胞凋亡。郭翠翠等[17]研究发现，分别敲除雄性小鼠的MIWI、MIWI2和MILI的纯合子，会造成生精停滞和生殖细胞凋亡，然而分别敲除雌性小鼠的MIWI、MIWI2和MILI的纯合子，其仍能产生正常后代，表明MIWI、MIWI2和MILI特异性作用于雄性生殖细胞，影响雄性生殖细胞的分化和成熟。近期研究[18]发现，磷脂酶D可影响piRNA的生成过程，其突变会使精子发生过程停滞在减数分裂阶段。此外，Gu等[19]研究发现，PIWI基因的遗传多态性也会导致精子发生缺陷，进而影响男性的生育能力。

4 lncRNA与精子发生

lncRNA为长度200 ～10 000个核苷酸的调控性非编码RNAs，其通过与蛋白质等生物大分子相互作用发挥其生物学功能。基因组计划研究显示，人类基因组绝大多数的转录产物为非编码RNAs，其中lncRNA所占的比例最大，其基因有10 000～20 000个，广泛分布在整个基因组中[20]。通常按照其功能将他们划分在相关蛋白质编码基因的对应位置，包括链方向不能被直接测定的基因内区或基因间区以及来自反链、假基因和转座子的外显子区。精子发生过程部分受到lncRNA的调节[21]，其中一些lncRNA是反义转录本，当睾丸中的反义转录本增高时，会使基因表达调控机制更加严格[22]。 lncRNA通常在转录和转录后水平上发挥其调控机制。在转录水平上，其通过促进特定组蛋白修饰来发挥调控作用，如HOTAIR（Hox转录本反义RNA）通过募集PRC2到HoxD位点从而抑制组蛋白H3修饰来调节转录过程[23]。在剪接过程中，lncRNA也可在转录后水平上发挥作用，如MALAT1（转移相关的肺腺癌转录本1）通过与剪接因子相互作用来调控转录本的选择剪接[24]。此外，精子中的lncRNA会呈现出与预期不同的亚型，主要是因为其来源于体细胞的表达。然而，精子中的lncRNA比睾丸更丰富，这种lncRNA在精子成熟、受精和早期胚胎发育过程中的功能作用还有待进一步研究。

5 问题与展望

生殖细胞将其遗传和表观遗传信息传递给下一代的能力高度表明正确的表观遗传标记建立与维持的重要性。广泛并准确的转录和转录后调控对精子发生各阶段中特异性基因的有序表达是至关重要的。随着基因组计划的完成，人们对调控性非编码RNAs的认识不断加深。这些非编码RNAs作为重要的表观遗传调控因子，对各种生物学过程中基因的表达具有重要调控作用。miRNA、siRNA、piRNA和lncRNA协同作用是雄性生殖细胞中基因表达和染色质重塑调控的主要机制之一。目前全球范围内男性不育疾病升高的趋势已经引起了生殖医学专家的广泛关注，遗传和环境因素均可导致男性生育能力下降甚至不育，目前大多采用辅助生殖技术进行治疗。表观遗传重编程贯穿于精子发生的整个过程，其对精子的正常发育非常重要,然而并不知道跨代遗传是否会造成关键分化过程的错误传达。由于调控性非编码RNAs是精子发生过程中基因表达和表观遗传事件的重要调控因子，他们可以作为男性不育疾病诊断的生物标志物，并且可以为男性不育治疗方法的选择提供理论指导。

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（责任编辑：刘俊华）

The role of regulatory non-coding RNAs during spermatogenesis

WANG Yan1, GUO Wenlong2, GENG Dehai2, WANG Bo3, ZHANG Jianli3, ZHANG Yanmin4, LIU Shuzhuo5
(1. College of Basic Medical Sciences of Hebei University, Baoding 071000, China; 2. Laishui County Hospital, Laishui 074100, China; 3. Yixian County Hospital, Yixian 074200, China; 4. Yixian County Hospital of Traditional Chinese Medicine, Yixian 074200, China; 5. Affiliated Hospital of Hebei University, Baoding 071000, China)

Global rise in male infertility as a result of falling sperm count and quality has been pointed out by many investigations. Therefore, it is essential to understand the molecular mechanism of spermatogenesis and its regulation. Spermatogenesis is characterized by three phases: mitosis, meiosis and spermiogenesiss, which are strictly regulated by phase-specific gene expression that is controlled by myriads of regulatory non-coding RNAs. Rapid advancement in genome mining technologies has identified role of regulatory non-coding RNAs including microRNA(miRNA), small-interfering RNA(siRNA), PIWI-interacting RNA(piRNA) and long noncoding RNA(lncRNA) as controllers of gene expression at transcriptional as well as post-transcriptional level in different biological context and disease processes. Here, we discuss the recent advances in our understanding about the involvement of these transcripts in spermatogenesis. In addition, we review here the relationship between their abnormal experssion and associated diseases.

regulatory non-coding RNAs; spermatogenesis; gene expression; male infertility

R69

1674-490X(2014)06-0095-05

2014-11-24

王燕（1974—），女，满族，河北易县人，副教授，硕士，主要从事生殖毒理学教学和科研。E-mail：wyry2004@163.com,

刘淑卓（1971—），女，河北保定人，主管检验师，主要从事临床检验。E-mail: cimeiliuxiang@126.com