杨育林，吉莹洁

（洛阳市食品药品检验所，河南洛阳471023）

莫匹罗星软膏微生物限度检查的方法学验证

杨育林，吉莹洁

（洛阳市食品药品检验所，河南洛阳471023）

目的建立莫匹罗星软膏的微生物限度检查方法。方法依据《中国药典》2010年版规定，采用常规法、培养基稀释法、薄膜过滤法进行方法验证。结果莫匹罗星软膏具有明显的抑菌活性。其微生物限度检查的细菌计数宜采用薄膜过滤法，真菌及酵母菌计数采用常规法；控制菌检查中的金黄色葡萄球菌宜采用薄膜过滤法，铜绿假单胞菌采用常规法。结论确立了莫匹罗星软膏的微生物限度检查方法，可有效控制其质量。

莫匹罗星软膏；微生物限度检查；方法验证

微生物限度检查是反映药品安全性的重要指标之一，《中国药典》明确规定，当建立药品的微生物限度检查法时，应进行方法验证［1］。验证的目的是确认所采用的方法是否适合于供试品的微生物限度检查。根据检查方法的不同，又分为细菌、真菌及酵母菌计数方法的验证和控制菌检查法的验证。莫匹罗星软膏为局部外用抗生素，适用于革兰阳性球菌引起的皮肤感染，因其具有抑菌活性，若不经方法学验证，难以保证所采用的方法适合该供试品的微生物限度检查，可能影响检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。故本文参考相关资料［2～7］，对其微生物限度检查方法进行考察，为以后检验提供依据。

1 材料

1.1 供试品 莫匹罗星软膏（中美天津史克制药有限公司，批号：12080735）。

1.2 菌种 大肠埃希菌［CMCC（B）44 102］、金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26 003］、枯草芽孢杆菌［CMCC（B）63 501］、铜绿假单胞菌［CMCC（B）10 104］、白色念珠菌［CMCC（F）98 001］、黑曲霉菌［CMCC（F）98 003］均由河南省食品药品检验所提供。

1.3 培养基和稀释液 所用培养基均由北京三药科技开发公司生产；0.9%无菌氯化钠溶液、pH 7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液由本所配制。

2 试验部分

2.1 菌液制备

2.1.1 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、与枯草芽孢杆菌的新鲜培养物于营养肉汤培养基中，35℃培养18～24 h，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成50～100 CFU·mL－1的菌悬液。

2.1.2 接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，25℃培养24～48 h，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成50～100 CFU·mL－1的菌悬液。

2.1.3 接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，25℃培养一周，加入3～5 mL含0.05%（V／V）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸出孢子菌液至灭菌试管内，用含0.05%（V／V）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成50～100 CFU·mL－1的孢子悬液。

2.2 供试液制备 取供试品10 g，加45℃恒温的pH 7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液100 mL，振摇使全部溶解，制成1∶10的供试液。

3 细菌、真菌及酵母菌计数方法验证

3.1 试验组

3.1.1 常规法 取1∶10供试液1 mL注入平皿，分别接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆、白色念珠菌和黑曲霉孢子悬液各1 mL，立即倾注15～20 mL相应培养基，平行制备两个平皿，待凝固后置规定温度培养至规定时间，观察结果。

3.1.2 培养基稀释法 取0.2 mL／皿的供试液，分别人工接种上述试验菌悬液1 mL，立即倾注15～20 mL相应培养基培养，待凝固后置规定温度培养至规定时间，观察结果。

3.1.3 薄膜过滤法 取1∶10的供试液1 mL，加至pH 7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液100 mL中，照薄膜过滤法过滤后，用pH 7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液冲洗滤膜5次，每次100 mL，在最后一次冲洗液中加入试验菌悬液1 mL，滤干，取出薄膜菌面朝上贴于相应培养基上，规定温度培养至规定时间，观察结果。

3.2 菌液组 按试验组各方法不加供试液操作，测定所加菌数。

3.3 供试品对照组 取供试液1 mL，按试验组操作，不加菌液，记录菌落数。

3.4 稀释剂对照组 取稀释液1 mL代替供试液，按试验组操作，记录菌落数。

3.5 回收率计算 试验组的菌回收率（%）＝（试验组平均菌落数－供试品对照组平均菌落数）／菌液组平均菌落数×100%；

稀释剂对照组的菌回收率（%）＝稀释剂对照组平均菌落数／菌液组平均菌落数×100%。

依法计算回收率，稀释剂对照组的菌回收率均高于70%，试验组的菌回收率结果见表1。

表1 试验组3次平行试验的菌回收率（%）

4 控制菌检查方法验证

4.1 铜绿假单胞菌 取4瓶胆盐乳糖培养基（100 mL／瓶），其中2瓶分别加入1：10供试液10 mL，一瓶作为供试品对照组，另一瓶加入铜绿假单胞菌悬液作为试验组；其余两瓶一瓶加入铜绿假单胞菌悬液作为阳性对照组，剩余一瓶加入10 mL稀释液作为阴性对照组；按铜绿假单胞菌检查法进行检查，结果见表2。

表2 铜绿假单胞菌方法验证结果

4.2 金黄色葡萄球菌

4.2.1 常规法 取4瓶营养肉汤培养基（100 mL／瓶），其中2瓶分别加入1∶10供试液10 mL，一瓶作为供试品对照组，另一瓶加入金黄色葡萄球菌悬液作为试验组；其余两瓶一瓶加入金黄色葡萄球菌悬液作为阳性对照组，剩余一瓶加入10 mL稀释液作为阴性对照组；按金黄色葡萄球菌检查法进行检查。

4.2.2 薄膜过滤法 取1∶10供试液10 mL，照薄膜过滤法过滤后，用pH 7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液冲洗滤膜5次，每次100 mL，在最后一次冲洗液中加入金黄色葡萄球菌，取出薄膜置于100 mL营养肉汤培养基中，作为试验组；按试验组方法不加试验菌悬液制备供试品对照组；按试验组方法不加供试液制备阳性对照组；取稀释液1 mL代替供试液，按试验组操作，不加试验菌悬液制备阴性对照组，按金黄色葡萄球菌检查法进行检查。

表3 金黄色葡萄球菌方法验证结果

5 结果与结论

由表1可见，采用常规法和培养基稀释法时莫匹罗星软膏对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的回收率均低于70%，证明这两种方法下其有明显抑菌作用；在改用薄膜过滤法后，各试验菌的回收率均高于70%，表明其抑菌作用已消除。由表2可以看出，采用常规法时莫匹罗星软膏对铜绿假单胞菌无抑制作用。由表3可以看出，采用常规法时，莫匹罗星软膏抑制了金黄色葡萄球菌的生长；而采用薄膜过滤法时，试验组和阳性对照组均检出试验菌。

根据以上分析，可以确立莫匹罗星软膏采用薄膜过滤法进行细菌计数，采用常规法进行真菌及酵母菌计数；控制菌检查中的铜绿假单胞菌检查采用常规法，金黄色葡萄球菌检查采用薄膜过滤法。

6 讨论

6.1 莫匹罗星软膏为亲水性软膏，辅料为聚乙二醇400和聚乙二醇3350，水中溶解性良好，在供试液制备过程中可直接加45℃恒温的pH 7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液分散溶解；薄膜过滤时，每张滤膜总冲洗量以500 mL为宜，过少的话不能完全消除其抑菌活性，过多则易损伤滤膜上的微生物。

6.2 试验用菌株的传代次数不得超过5代，并应采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证其生物学特性。菌液制备后应在规定期限内使用，菌数应符合药典要求。

6.3 做试验菌的回收率试验时，加入菌量50～100 CFU为宜。若加菌量过多，采用薄膜过滤法时，菌落拥挤，不好计数；加菌量过少，则误差较大。

6.4 测定回收率时，供试液加入菌液后，应及时倾注培养基，以避免有抑菌性的供试液对菌液中的活菌造成损害，影响回收率。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版（二部）［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：附录107－116.

［2］中国药品生物制品检定所，中国药品检验总所.中国药品检验标准操作规范（2010年版）［M］.北京：中国医药科技出版社，2010：351－407.

［3］苏德模，马续荣.药品微生物学检验技术［M］.北京：华龄出版社，2007：221－227.

［4］杨静.药品微生物限度检查法的影响因素分析［J］.中国药事，2008，22（12）：1095－1096.

［5］杜鹃，范兵，冯慰民，等.三类不同药品的微生物限度检验方法验证比较［J］.药物分析杂志，2006，26（6）：840－842.

［6］国明，祝清芬，郑力真.无菌、微生物限度及细菌内毒素检查方法学验证中常见问题及分析［J］.中国药品标准，2008，9（1）：46－49.

［7］陈健梅.微生物检查方法验证及其影响因素分析［J］.中国医药导报，2008，5（12）：66－68.

Verification ofmethodology for them icrobial lim it test of M upirocin Ointment

YANG Yu-lin，JIYing-jie
（Luoyang Institute for Food and Drug Control，Luoyang 471023，China）

ObjectiveTo establish a microbial limit testmethod for Mupirocin Ointment.M ethodsAccording to Chinese Pharmacopoeia，common method，dilution method and membrane filtration method were used for the verification of methodology on Mupirocin Ointment.ResultsThe results suggested thatmembrane filtrationmethod can be used for count of bacteria and detection of staphylococcus aureus.Commonmethod can be used for count ofmolds and yeasts，detection of pseudomonas aeruginosa.ConclusionThemicrobial limit testof Mupirocin Ointmentwas established，and themethod was assured.

Mupirocin ointment；Microbial limit test；Verification ofmethodology

R927.11

A

2095－5375（2014）10－0592－003

杨育林，男，主管药师，研究方向：药品检验，E－mail：yyl009＠126.com