刘青芝，林永强，林 晓，郭东晓

（1.山东省医药工业设计院，山东济南250013；2.山东省食品药品检验研究院，山东济南250101）

清热解毒口服液中山银花的检查方法研究

刘青芝1，林永强2，林 晓2，郭东晓2

（1.山东省医药工业设计院，山东济南250013；2.山东省食品药品检验研究院，山东济南250101）

目的建立薄层色谱法和高效液相色谱－蒸发光散射检测法（HPLC－ELSD），对清热解毒口服液进行山银花检查。方法清热解毒口服液样品以D101大孔吸附树脂处理，富集山银花的特征成分灰毡毛忍冬皂苷乙。以该成分为山银花的检出指标，采用TLC法进行样品的初筛，并以HPLC－ELSD法进行限量检查。结果两个厂家提供的样品中检出山银花。结论建立的方法简便、准确，可用于判断清热解毒口服液中金银花的投料情况。

清热解毒口服液；金银花；山银花；灰毡毛忍冬皂苷乙

《中国药典》1963年版首次收载金银花，植物来源只有1种：忍冬科植物忍冬。《中国药典》1977年版其来源增加了3种：红腺忍冬、山银花和毛花柱忍冬。金银花的4种来源在此后的1985、1990、1995、2000年版药典中均未作改变，直至《中国药典》2005年版将金银花分列为金银花和山银花，金银花的来源修改为与1963年版相同；山银花的来源为灰毡毛忍冬、红腺忍冬和华南忍冬。《中国药典》2010年版山银花药材项下增加了黄褐毛忍冬［1～4］。

由于各版《中国药典》中金银花药材来源的改变，金银花和山银花在中药制剂中的应用比较混乱，但常规检验项目不能将二者区分开。灰毡毛忍冬皂苷乙（灰乙）和川续断皂苷乙（川乙）为山银花的专属成分，现有文献多以这两种三萜皂苷作为指标，建立山银花的检查方法［5，6］。对于药材和处方简单的制剂，由于干扰成分少，结果易于判断；而处方复杂的制剂中，可能含有影响结果判断的成分。参考相关文献［1，7，8］，我们选择处方比较复杂的清热解毒口服液（由石膏、金银花、玄参、地黄等十二味中药组成），以D101大孔吸附树脂富集三萜皂苷并除杂，建立了该制剂中山银花的TLC和HPLC检查方法，并对4个生产厂家的4批样品进行了检测。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent1200高效液相色谱仪（ELSD检测器）；Sartorius CP225D电子天平。Merck硅胶G薄层层析板。

1.2 试药 对照药材来源：金银花，中国食品药品检定研究院提供，批号：121060－201107；山银花，中国食品药品检定研究院，批号：121595－201202。对照品来源：灰毡毛忍冬皂苷乙，中国食品药品检定研究院提供，批号：111814－201303，含量以92.8%计；川续断皂苷乙，中国食品药品检定研究院提供，批号：111813－201202，含量以93.4%计。甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。收集的4批样品：企业A，批号：130601，规格：200 mL／支（无蔗糖）；企业B，批号：120701，规格：20 mL／支（无蔗糖）；企业C，批号：13062727，规格：10 mL／支；企业D，批号：13070005，规格：10 mL／支。

2 TLC方法与结果

2.1 色谱条件 硅胶G薄层板，以三氯甲烷－甲醇－水（6∶4∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。

2.2 对照品溶液 分别取灰乙和川乙对照品约1 mg，各加甲醇1 mL使溶解，摇匀，得到灰乙和川乙对照品溶液。

2.3 对照药材溶液 分别取金银花和山银花对照药材0.5 g，各加甲醇10 mL，超声处理10 min，滤过，取续滤液，作为金银花和山银花对照药材溶液。

2.4 供试品溶液 取本品20 mL，加在D101型大孔吸附树脂柱（内径为2.0 cm，柱高为20 cm），用水200 mL洗脱，弃去水液，再用甲醇200 mL洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂至干（温度低于60℃），残渣加50%甲醇5 mL使溶解，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.5 阴性对照溶液 取处方中所有药味，按处方比例制成缺山银花的阴性对照样品。取阴性对照样品20 mL，按“2.4”项下方法制成阴性对照溶液。

2.6 阳性对照溶液 取山银花替代金银花，以及处方中其他药味，按处方比例制成山银花阳性对照样品。取阳性对照样品20 mL，按“2.4”项下方法制成阳性对照溶液。

2.7 方法学考察和样品测定 取收集到的4个生产企业的样品，按“2.4”项下方法分别制成供试品溶液。取供试品溶液，以及“2.2～2.6”项下灰乙对照品溶液、川乙对照品溶液、金银花对照药材溶液、山银花对照药材溶液、缺山银花阴性对照溶液和山银花阳性对照溶液各2μL，按“2.1”项下条件，进行TLC试验，结果见图1。

图1 TLC方法学考察和样品测定薄层色谱图

2.8 检验依据的选择 根据TLC结果（见图1），缺山银花阴性对照和金银花对照药材在灰乙对照品相应位置无斑点，山银花阳性对照和山银花对照药材在相应位置斑点明显，因而灰乙可以作为山银花的检出依据；缺山银花阴性对照在川乙对照品相应位置有干扰，且供试品溶液在相应位置斑点较多，干扰结果的判断，故不采用川乙作为山银花的检出依据。4批样品的测定结果见表1。

表1 样品测定结果

3 HPLC方法与结果

3.1 色谱条件 依利特Hypersil BDS C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，梯度洗脱（0～12 min，20%A→28% A；12～27 min，28%A→33%A；27～30 min，33%A；30～33 min，33%A→20%A；33～40 min，20%A）；蒸发光散射检测器检测。理论板数按灰乙峰计算应不低于5 000。

3.2 混合对照品溶液的制备 精密称取灰乙对照品18.19 mg，置10 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为灰乙对照品储备液。精密称取川乙对照品22.86 mg，置10 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为川乙对照品储备液。分别精密吸取上述两种对照品储备液各1.5 mL和1 mL，置同一10 mL容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液（灰乙、川乙浓度分别为0.253 2、0.213 5 mg·mL－1）。

3.3 对照药材溶液 分别取金银花和山银花对照药材粉末0.5 g，精密称定，置50 mL容量瓶中，加50%甲醇适量，超声处理40 min，放冷，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为金银花和山银花对照药材溶液。

3.4 供试品溶液 精密量取装量项下的本品20 mL，加在D101型大孔吸附树脂柱（内径为2.0 cm，柱高为20 cm），用水200 mL洗脱，弃去水液，再用甲醇200 mL洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂至干（温度低于60℃），残渣加50%甲醇溶解，转移至25 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3.5 阴性对照溶液 取“2.5”项下缺山银花的阴性对照样品，按“3.4”项下方法制成阴性对照溶液。

3.6 阳性对照溶液 取“2.6”项下山银花阳性对照样品，按“3.4”项下方法制成阳性对照溶液。

3.7 方法学考察

3.7.1 专属性 分别精密吸取“3.2”项下混和对照品溶液、“3.5”项下缺山银花阴性对照溶液和3.6项下山银花阳性对照溶液各10μL，注入液相色谱仪，按“3.1“项下方法进行测定，结果见图2。山银花投料制备的阳性对照色谱中，呈现与灰乙保留时间相同的色谱峰；金银花投料制备的正常样品（阴性对照）色谱中无相应色谱峰。综上，上述检测方法可以区分清热解毒口服液样品的金银花投料情况。山银花阳性对照色谱中，川乙峰面积较小，不适合作为山银花的检出依据，故本方法学考察主要研究以灰乙作为山银花的检出指标。

3.7.2 线性关系的考察 精密吸取“3.2”项下混合对照品溶液各3、5、7、10、15、18、20μL，注入液相色谱仪，分别测定峰面积。以灰乙进样量的自然对数为横坐标，峰面积的自然对数为纵坐标，进行线性回归，得回归方程Y＝1.693 3X＋4.486，r＝1.000。灰乙进样量在0.759 6～5.064 0μg之间，其自然对数与峰面积积分值自然对数呈良好的线性关系。

3.7.3 仪器精密度试验 精密吸取“3.2“项下混合对照品溶液20μL，注入液相色谱仪，连续进样6次，取灰乙峰面积自然对数，RSD为0.31%，表明仪器精密度良好。

3.7.4 检测限和定量限 分别配制一个较低浓度的对照品溶液，精密吸取10μL，注入液相色谱仪，观察其峰高与基线噪音的比值（即信噪比S／N），当S／N等于3时，此时的浓度为检测限，当S／N等于10时，此时的浓度为定量限。灰乙的检测限为0.025 3 mg·mL－1，定量限为0.050 6 mg·mL－1。

图2 山银花检查专属性试验HPLC色谱图

3.7.5 稳定性试验 取企业D批号为13070005的样品，照“3.4”项下方法制备供试品溶液，精密吸取10μL，注入液相色谱仪，每隔5 h进样一次，测定色谱峰的峰面积，共考察25 h。灰乙峰面积自然对数的RSD为0.48%，表明供试品溶液在25 h内稳定性良好。

3.7.6 重复性考察 取企业D批号为13070005的样品，照“3.4”项下方法制备供试品溶液，平行制备6份。分别精密吸取“3.2”项下的混合对照品溶液5、20μL及供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，测定。以灰乙对照品进样量的自然对数为横坐标，峰面积的自然对数为纵坐标，得标准曲线Y＝1.690 3X＋4.482 7，以标准曲线测定样品中的灰乙含量，6份样品测定结果RSD为1.22%，方法重复性良好。

3.7.7 加样回收率 取企业D批号为13070005的样品，精密量取10mL（灰乙含量为0.550 1mg·mL－1），精密量取灰乙对照品溶液（浓度为1.495 9 mg·mL－1）3 mL和水7 mL置同一25 mL烧杯中，摇匀，照“3.4”项下方法制成供试品溶液，平行制备6份。分别精密吸取“3.2”项下的混合对照品溶液5、20 μL及供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，结果表明，测定方法的回收率良好，结果见表2。

3.8 样品测定 精密量取装量项下的本品20 mL，照“3.4”项下方法制成供试品溶液，平行制备2份。分别精密吸取对照品溶液5、20μL及供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，测定，结果见表1，HPLC与TLC检验结果一致。

表2 灰乙加样回收率考察结果

4 讨论

4.1 TLC法

4.1.1 考察了直接点样、硅藻土除杂和D101大孔吸附树脂除杂法。由于受到其他成分斑点的干扰，前两种方法均无法准确判断是否检出山银花，而D101大孔吸附树脂处理后，灰乙斑点清晰，可作为检出山银花的依据。

4.1.2 比较了日光和365 nm下两种观察方式，发现日光下无干扰，而365 nm下灰乙斑点附近略有干扰，可能影响结果判断，因而选择日光下观察。

4.1.3 考察了乙酸丁酯－甲酸－水（7∶5∶5）的上层溶液和三氯甲烷－甲醇－水（6∶4∶1）两种展开剂。前一种展开剂条件下，灰乙斑点的Rf值较小（约为0.2），在样品图谱中易受杂质干扰，影响结果判定，并且展开时间较长，故未采用。

4.1.4 考察了不同厂家硅胶G板（Merck公司和青岛海洋化工分厂）及不同温湿度条件（19℃，相对湿度44%；26℃，相对湿度33%），TLC色谱图均斑点清晰、分离效果较好，证明TLC色谱条件耐用性较好。

4.2 HPLC法

4.2.1 HPLC流动相还考察了乙腈（A）－0.4%磷酸溶液（B）梯度洗脱，梯度条件：0～10 min，11.5% A→15%A；10～12 min，15%A→29%A；12～18 min，29%A→33%A；18～30 min，33%A→45%A。该色谱条件下，供试品溶液中灰乙色谱峰与相邻峰的分离度较差，故未采用。

4.2.2 考察了依利特Hypersil BDS、Thermo BDS和Kromasil 3种不同品牌的色谱柱（规格均为4.6 mm ×250 mm，5μm），灰乙色谱峰的对称因子、理论板数和分离度等均符合要求，该方法对3种色谱柱适用性良好，对色谱柱选择性不强。

4.2.3 根据灰乙的检测限（0.025 3 mg·mL－1），建议规定清热解毒口服液样品中灰乙含量不得过0.03 mg·mL－1。

以建立的TLC和HPLC法考察4家生产企业的4批清热解毒口服液，其中两批样品检出山银花，且远超出灰乙检测限。根据本次检验结果，清热解毒口服液生产企业以山银花代替金银花投料的情况比较严重，增加山银花的检查是十分必要的。

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Inspection of Lonicerae flos in Qingre Jiedu Oral Solution

LIU Qing-zhi1，LIN Yong-qiang2，LIN Xiao2，GUO Dong-xiao2
（1.Shandong Pharmaceutical Industry Designing Institute，Jinan 250013，China；2.Shandong Institute for Food and Drug Control，Jinan 250101，China）

ObjectiveTo establish TLC and HPLC－ELSD methods for the inspection of Lonicerae flos in Qingre Jiedu Oral Solution.MethodsThe sample of Qingre Jiedu Oral Solution was chromatographed over a D101 macroporous resin column to enrich macranthoidin B，which was a characteristic component of Lonicerae flos and thus used as the detection index.Preliminary screening of the inspection was carried out with a TLCmethod；An HPLC－ELSD method was applied to determine the contentof Lonicerae flos.ResultsLonicerae floswas detected in samples supplied from two enterprises.ConclusionThemethodswere simple and accurate，which can be applied to detect the use of Lonicerae japonicae flos in Qingre Jiedu Oral Solution.

Qingre Jiedu Oral Solution；Lonicerae japonicae flos；Lonicerae flos；Macranthoidin B

R927.1

A

2095－5375（2014）10－0574－004

国家重大新药创制中药安全检测技术及标准平台（No.2014ZX09304307）——中药质量安全检测和风险控制技术平台（No.2014ZX0930437－002）；山东省自然科学基金项目（No.ZR2013HM074）

刘青芝，女，研究方向：医药工艺设计，E－mail：qzhiliu＠gmail.com

郭东晓，男，主管药师，研究方向：药物分析，Tel：0531－81216523，E－mail：guodx0212＠126.com