赵 影，徐海燕，辛国芹，武香玉，谷 巍

（山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东泰安271000）

产梓醇地黄内生菌的分离鉴定及遗传稳定性研究

赵 影，徐海燕，辛国芹，武香玉，谷 巍

（山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东泰安271000）

通过组织分离法从野生地黄组织中分离得到24株内生菌，采用2，4－二硝基苯肼显色法对所分离的菌株进行产梓醇性能的测定，筛选得到一株产梓醇性能较好的菌株BLCC1－0148，研究其10代内培养物产梓醇性能的遗传稳定性，结合菌落形态特征及菌株特异性序列分析等手段，最终将BLCC1－0148鉴定为蜡样芽孢杆菌（Bacillus Cereus）。利用正交设计试验对高产菌株BLCC1－0148进行发酵条件的优化，最佳发酵培养基如下：葡萄糖0.5%、蛋白胨0.5%、酵母膏0.75%、氯化钠1%；发酵温度37℃，摇床转数180 rpm，发酵时间3 d，梓醇产量达到839μg·mL－1；

分离鉴定；地黄；内生菌；遗传稳定性；系统发育分析

植物内生菌［1，2］（plant entophytes）是指一类在其部分或全部生活史中存活于健康植物组织内部，而不使宿主植物表现出明显感染症状或利于宿主生长的微生物。研究表明，植物尤其是中药内生菌能够产生与宿主相同或相似的药用活性成分及多种全新的代谢产物［3］，其中的很多成分对人类疾病的防治和预防有很好的效果［4～6］。

地黄是我国传统中药材，已证实梓醇是地黄的主要有效成分［7］，具有降血压、利尿和缓泻、抗炎、保肝及调节免疫功能的作用［8，9］。但是地黄体内梓醇活性成分含量往往都很低，而且供应还会收到季节性的限制。本研究从野生地黄组织中分离筛选产梓醇性能较好的菌株并研究其产梓醇的遗传稳定性，对于更好地开发利用地黄内生菌提供参考，并为开发新的生物资源提供基础和依据。

1 试验材料

1.1 材料 分离源：野生地黄叶片、块茎、根等。

1.2 分离培养基 改良的MRS培养基：蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母膏0.5%、葡萄糖2%、磷酸氢二钾0.2%、乙酸钠0.5%、柠檬酸铵0.2%、硫酸镁0.02%、硫酸锰0.05%、吐温－80 0.1%、pH值6.5（分离乳酸菌）。

LB培养基：酵母膏0.5%、蛋白胨1%、NaCl 1%，pH值为7.0（分离芽孢菌等其他细菌）

PDA培养基：马铃薯20%（煮汁），葡萄糖20 g，琼脂15 g，pH自然（分离真菌）。

1.3 发酵培养基 乳酸菌发酵培养基为MRS液体培养基；芽孢等细菌发酵培养基为LB液体养基；真菌发酵培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）；指示菌发酵培养基：同芽孢菌培养基。

2 试验方法

2.1 样品采集与处理 采集泰安地区野生地黄叶片、块茎、根等，置于无菌塑料袋中，尽快进行表面消毒处理。

2.2 内生菌的分离和纯化 采用组织块法对所采集的植物组织进行内生菌的分离。取采集的新鲜样品，用蒸馏水将植物表面洗净，稍干后取其根、茎、叶切成适宜大小的小段，在75%乙醇中浸泡lmin，无菌水漂洗3次后用2.5%NaClO，茎、叶消毒2 min，皮消毒3 min，最后再用无菌水冲洗3～4次，无菌滤纸吸干。去边缘，切成约0.5 cm×0.5 cm的小块贴放于分离培养基上，每皿4～6块，置37℃和28℃恒温培养箱中培养2～7 d，待培养基上植物组织周围长出菌落后，挑取转移至新的培养基平板上划线法纯化，纯化的单菌落保存至斜面4℃保存，或者甘油管及冻干粉保存。

挑取分离纯化，油镜观察菌体形态和纯度，据伯杰氏细菌鉴定手册初步对分离的菌株进行鉴定。

2.3 产梓醇地黄内生菌的分离筛选 将菌种接种在斜面培养基中，37℃培养复壮，24 h后传代到装有50 mL液体种子培养基的250 mL三角瓶中，37℃恒温振荡培养（180 rpm）24 h，然后接种到装有100 mL发酵培养基的500 mL三角瓶中，37℃恒温振荡（180 rpm）培养72 h，5 000 rpm离心分离菌体和上清液，上清液即为代谢产物，用于进一步分析。

2.3.1 标准曲线的绘制 用移液枪准确吸取2 501 μg·mL－1的梓醇标准样品溶液0.00、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00 mL，分别置于10 mL量瓶中，加20%乙醇至2 mL，分别加入2.5 mL 2，4－二硝基苯肼显色剂，摇匀。加20%乙醇至刻度，反应30 min后，照紫外－可见分光光度法，在波长470 nm处测定其吸光度，以吸光度为纵坐标，以梓醇标准品溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。

2.3.2 测定 准确吸取2.00 mL样品分别置于10 mL量瓶中，分别加入2.5mL 2，4－二硝基苯肼显色剂，摇匀。加20%乙醇至刻度，反应30 min后，在波长470 nm处测定各样品吸光度值，以20%乙醇为空白对照。

2.4 产梓醇性能较好地黄内生菌菌株遗传稳定性测定 将筛选出的产梓醇性能较好的菌株在LB斜面上进行划线培养，并连续进行至十代，观察菌株各培养阶段的生长性能及形态差异，并将各代菌株活化培养同时测定产梓醇的性能。

2.5 产梓醇性能优越地黄内生菌发酵条件的优化以LB培养基为基础，在4因素3水平上做一下正交化试验。

2.6 菌株的鉴定

2.6.1 生理生化鉴定 根据分离菌的菌落和菌体形态，革兰染色以及生理生化反应，按《伯杰氏细菌鉴定手册》进行初步归属。

2.6.2 16S rDNA的扩增与序列分析 目的菌株接种于新鲜的MRS培养基中培养20 h，采用天根公司的试剂盒提取菌体DNA，并对其进行16S rDNA序列扩增。所用引物为通用引物：1492r：5′－ggttaccttgttacgactt－3′，27f：5′－agagttgatcctggctcag－3′，PCR反应体系（50μL）为：Mixture 25μL（含Taq DNA聚合酶及dNTP等，天根生化科技有限公司），上下游引物各1μL，模板DNA 2μL，超纯水21μL。PCR扩增程序为94℃预变性5 min，94℃变性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸2 min，25个循环，72℃延伸10 min。PCR产物送北京博尚生物技术有限公司进行序列测定。

2.6.3 系统发育分析 登录GenBank（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov）对菌株16S rDNA测序结果利用Blast进行检索，并下载相关属种的16S rDNA序列，采用DNAMAN、DNAclub、MEGA 3.1等软件进行同源性分析，并构建系统进化树。

3 结果

3.1 地黄内生菌的分离 从泰安周边野生的地黄组织中成功分离得到24株内生菌，如表1所示。

表1 地黄内生菌分离结果

续表1：

3.2 产梓醇地黄内生菌的筛选

3.2.1 梓醇标准曲线的绘制 见图1。

图1 梓醇标准曲线

由标准曲线可得浓度计算公式为：Y＝0.533 7X－0.022 5，其中X：OD470，Y：样品浓度（mg·mL－1）。

3.2.2 各菌株发酵液结果测定 采用分光光度法对所分离的菌株进行产梓醇能力的测定，结果如表2所示。

表2 各地黄内生菌产梓醇能力测定结果

由表2可知分离筛选得到的BLCC1－0148菌株经过液体发酵后梓醇的产量最高，达到了247.367μg·mL－1。故选取BLCC1－0148菌株进行后续试验。

3.3 BLCC1－0148菌株遗传稳定性测定 将筛选出BLCC1－0148菌株进行遗传稳定性测定，结果如表3所示。

表3 BLCC1－0148菌株遗传稳定性测定结果

由表3可以看出菌株BLCC1－0148的10代内培养物在37℃、180 rpm条件下发酵72 h产梓醇性能比较稳定，发酵液中梓醇含量分别维持在270μg·mL－1水平上左右，说明所分离筛选的地黄内生菌BLCC1－0148在10代以内产梓醇的性能比较稳定，其遗传稳定性较好。

3.4 BLCC1－0148菌株发酵条件的优化 以LB培养基为基础，在4因素3水平上做正交试验，结果如表4所示。

表4 BLCC1－0148菌株培养基优化结果

由表4结果筛选出了BLCC1－0148菌株发酵产梓醇培养基最佳配方：葡萄糖0.5%、蛋白胨0.5%、酵母膏0.75%、氯化钠1%，梓醇产量达到839μg·mL－1。

3.5 菌株BLCC1－0148的鉴定 挑取菌株BLCC1－0148纯培养物接种于LB培养基平皿，37℃培养20 h，形成灰白色菌落，不透明，表面较粗糙，似毛玻璃状或融蜡状（如图2）。光学显微镜下观察，革兰阳性，杆状（如图3）。

菌株BLCC1－0148的16S rDNA PCR条带在1 000～2 000 bp之间，约为1.5kb的单一扩增产物（如图4）。将该序列与GenBank的核酸数据作同源性比对。结果表明，与已知蜡样芽孢杆菌EF473128等16S rDNA序列的同源率为100%，菌株BLCC1－0148鉴定为蜡样芽孢杆菌（Bacillus Cereus）（如图5）。

图2 BLCC1－0148的菌落培养性状

图3 BLCC1－0148的菌体形态（油镜观察）

图4 菌株BLCC1－0148 16S rDNA基因的PCR扩增电泳图M.Marker；1.BLCC1－0148

图5 菌株BLCC1－0148的系统发育进化

4 讨论

从中药材的根茎叶中可以分离到内生菌，且可以通过改良的培养基筛选出产与宿主相同或相似的药用活性成分的菌株，然后将菌株接种在适宜的培养基中发酵培养，之后将活性成分从培养基中分离纯化出来，这样就可以缓解中药材的供应紧张问题［10］。利用中药材内生菌进行工业发酵生产重要的药物具有极大的应用价值和开发潜力。分离出与寄主共生的内生菌，并利用内生菌来发酵产生与寄主相似药效成分的构思，这样既可以节约药材，降低生产成本还可以弥补季节性的缺陷，实现循环可持续地生产。因此，对植物尤其是中药内生菌资源的开发和利用可以缓解中药材的供应紧张问题，有很好的应用前景和实际意义。

综上所述，从泰安野生地黄组织中分离得到24株内生菌，并对其产梓醇性能进行测定，结果筛选出1株产梓醇性能优越的菌株BLCC1－0148，经系统发育分析所分离的菌BLCC1－0148鉴定为蜡样芽孢杆菌（Bacillus Cereus）。通过正交试验设计得到了BLCC1－0148菌株发酵产梓醇培养基最佳配方：葡萄糖0.5%、蛋白胨0.5%、酵母膏0.75%、氯化钠1%，梓醇产量达到839μg·mL－1；研究发现所筛选的地黄内生菌BLCC1－0148在10代内产梓醇的遗传稳定性较好，由此可以说明内生菌的分离筛选为中药活性成分的供给提供一种新思路，而且通过内生菌的发酵代谢产生地黄药效成分及其他活性物质，既可以用在相关药物领域中的有效成分的添加也可以部分替代地黄的种植，减少季节性供应的限制，提高产量，大大降低生产成本。有希望解决药材供需严重失衡的问题，有可能从根本上解决药用植物的供应问题。

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Isolation and identification of endophytic bacteria produced catalpol from rehmannia and studies on genetic stability

ZHAO Ying，XU Hai-yan，XIN Guo-qin，WU Xiang-yu，GUWei
（Shandong Baolai－leelai Bioengineering Co.，Ltd.，Taian 271000，China）

24 strains of entophyte were isolated from Rehmannia by tissue isolation.The2，4－dinitrobenzene hydrazine chromogenicmethod were used to determing the performance of catalpa alcohol from separated strains.The strain BLCC1－0148 with better performance production of catalpol and good genetic stability were screened and had been identified as Bacillus Cereus by based on physiological，biochemical characteristics and 16S rDNA sequence phylogeny analysis.The cultural conditions of BLCC1－0148 strain was optimized by the orthogonal design experiment.The optimum medium composition of fermentation conditions was as follows：glucose 0.5%，tryptone 0.5%，yeast extract 0.75%，NaCl 1%.The fermentation conditions included cultural temperature 37℃，rotational speed of rocking bed 180 rpm，fermentation time 3d.The production of catalpol reached 839μg·mL－1.

Isolation and identification；Rehmannia；Endophyte；Genetic stability；Phylogenetic analysis

Q93－331

A

2095－5375（2014）10－0567－005

赵影，女，研究方向：动物微生态，E－mail：zy198709050025＠163.com

徐海燕，女，研究方向：动物微生态，Tel：13695385458，E－mail：xucaoyichuan＠163.com