齐玉明，成艳梅，李 彦，李 研，贾 丽

(河北省邯郸市中心医院，河北 邯郸 056001)

GPC-3在卵巢透明细胞癌和浆液性癌中的差异表达

齐玉明，成艳梅，李 彦，李 研，贾 丽

(河北省邯郸市中心医院，河北 邯郸 056001)

目的 检测GPC-3在卵巢透明细胞癌与浆液性癌中的差异表达，判断卵巢透明细胞癌与不良预后的关系。方法 采用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶连接(SP)法和逆转录RT-PCR技术，检测GPC-3在卵巢透明细胞癌和浆液性囊腺癌中的差异表达。结果 GPC-3在卵巢透明细胞癌中的表达明显高于卵巢浆液性囊腺癌(P<0.05)；且GPC-3在卵巢透明细胞癌中的表达与铂类耐药有关。结论 GPC-3的过表达与肿瘤的低分化和以铂类为基础的化疗耐药有关，而且与卵巢透明细胞癌的不良预后有关。

卵巢透明细胞癌；GPC-3；铂类耐药；预后

卵巢透明细胞癌是卵巢上皮性肿瘤中的一种，但它的生物学行为与其他上皮性肿瘤明显不同。和其他上皮性卵巢癌相比，卵巢透明细胞癌预后更差，即使早期发现，预后仍然不良。既往研究发现，多种基因与卵巢透明细胞癌不良预后有关，但迄今为止，仍未能找到一种有效区分卵巢透明细胞癌和大多数上皮性卵巢癌的标志物用于临床诊断和评价该肿瘤。本研究通过定量PCR和免疫组化方法，检测GPC-3在卵巢透明细胞癌和浆液性癌组织的表达差异，判断卵巢透明细胞癌的预后。

1 临床资料

1.1 一般资料 选择2004年6月—2010年5月我院收治的16例卵巢透明细胞癌组织标本(I期4例，Ⅱ期7例，Ⅲ期3例，Ⅳ期2例)作为实验组，患者平均年龄53.2岁。对照组为同期收治的22例浆液性囊腺癌组织标本(Ⅰ期3例，Ⅱ期5例，Ⅲ期14例)，患者平均年龄54.6岁。2组年龄差异无统计学意义，标本实验前均经冰冻切片、HE染色、病理检查证实。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 肿瘤切下后,从肿瘤生长活跃、无坏死的边缘部位取下约1 cm3大小的组织2块，一块放入甲醛溶液固定、石蜡包埋，用于免疫组化测定；另一块装入酶灭活的冻存管，迅速投入液氮中，然后转入-80 ℃冰箱保存待测。

1.2.2 免疫组化检测 采用免疫组化法检测卵巢透明细胞癌组织与卵巢浆液性囊腺癌组织中GPC-3的表达：标本常规脱水、包埋并制成4 μm厚的连续切片，采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接(SP)法进行组化检测。兔抗人多克隆HuR抗体为Santa Cruz产品，兔SP免疫组化试剂盒、DAB试剂盒均购于北京中杉金桥试剂公司。染色步骤按SP试剂盒(北京中杉金桥试剂公司)说明书进行，一抗滴度为1∶200。磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。

1.2.3 RT-PCR检测 采用RT-PCR技术检测卵巢透明细胞癌组织与卵巢浆液性囊腺癌组织中GPC-3 mRNA的表达，引物及试剂盒由北京赛百盛基因有限公司提供。采用TRIzol一步法提取组织总RNA。反应总体积20 μL，RNA模板量1 μg，参照试剂盒说明进行。产物长度及引物序列如下：GPC-3上游引物为5′-CTCCTAGCTCCCTGCGAAG和5′-TCTCCAGTACTTGTCAATCTC，下游引物为5′-GTTACTGCAATGTGGTCATGC和5′-ACATGTGCTGGGCACCAG；β-actin上游引物为5′-TCTACAATGAGCTGCGTGTG-3’，下游引物为5′-CATCTCTTGCTCGAAGTCC-3’。 PCR反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性40 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，33次循环后72 ℃延伸 5 min。取5 μL PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，β-actin作为内参照物，紫外透射成像系统显像，测定特异条带的密度并与内参照比较，得出目的基因mRNA的相对表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。计数资料采用2检验，等级资料的组间比较采用秩和检验。取α=0.05为检验水准,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 GPC-3在卵巢透明细胞癌和卵巢浆液性囊腺癌的表达 GPC-3在卵巢透明细胞癌的阳性表达率为56%(9/16)，而在卵巢浆液性囊腺癌中的阳性表达率为18%(4/22)，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 GPC-3 mRNA在卵巢透明细胞癌和卵巢浆液性囊腺癌的表达 16例卵巢透明细胞癌中10例呈阳性表达(62%)，22例卵巢浆液性囊腺癌中5例呈阳性表达(23%)，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)；透明细胞癌和浆液性囊腺癌组织中GPC-3 mRNA表达水平分别为0.381±0.036和0.114±0.021，两者比较差异有统计学意义(P<0.01)。

3 讨 论

卵巢透明细胞癌是上皮性卵巢癌中较为罕见的病理类型，但却有不同于其他上皮性卵巢癌的临床特征和极不良的预后[1]。由于卵巢透明细胞癌相对于其他上皮性卵巢癌更容易发生肿瘤转移和化疗耐药，从而导致该肿瘤预后不良。

GPC-3是一种硫酸肝素类蛋白多糖，由蛋白质、脂质和糖三者共价连接的复杂糖复合物，广泛存在于细胞表面，通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定于细胞膜表面，目前认为其HS基与大量生物效应分子(包括生长因子及其受体、细胞外基质蛋白和黏附分子等)相互作用，故而参与调节细胞增殖、分化、黏附和迁移等[2]。其Arg(358)与Ser(359)间分裂可产生可溶性NH2端(sGPC-3)，在原发性肝癌患者血清中特异性升高[3]。研究发现GPC-3主要通过Wnts信号途径产生作用，而且GPC-3对于经典途径和非经典途径Wnts途径都有调节作用。GPC-3通过自分泌和旁分泌的方式来激活经典Wnt信号途径使Wnt基因高表达，而Wnt基因的表达产物能够促进多种肿瘤组织生长，通过促进Wnt与其特异的Frizzled受体结合，促进细胞的恶性转化和肿瘤的持续增殖。

近来研究表明，GPC-3在多种肿瘤组织中表达上调，如肝癌、恶性黑素瘤、卵巢透明细胞癌、神经母细胞瘤、肾母细胞瘤、睾丸癌、脂肪肉瘤等，提示GPC-3与肿瘤的发生发展密切相关[4]。

肿瘤耐药方面的研究表明，卵巢透明细胞癌中GPC-3表达阳性的铂类耐药的发生率比GPC-3阴性的铂类耐药发生率高[5]。GPC-3中与X相连的SGBS的表达缺失导致GPC-3在卵巢恶性肿瘤表达上调，促进恶性肿瘤细胞增殖和分化。Shirakawa等[2]研究结果表明，GPC-3的表达上调与肝癌的不良预后和化疗耐药密切相关。

卵巢透明细胞癌相对于其他上皮性卵巢癌更容易发生肿瘤的转移和化疗耐药，这是导致该肿瘤预后不良的重要因素。因为卵巢透明细胞癌相对于其他上皮性癌表现出一种低水平的增殖。高度增殖的细胞对化疗是敏感的，而低度增殖的细胞对于化疗是不敏感的，这也就解释了卵巢透明细胞癌对化疗耐药的原因。在小鼠体内的研究表明[6]，GPC-3可抑制细胞的增殖，促进细胞的凋亡。本研究结果表明，GPC-3阳性患者是一种低水平的增殖，从而导致肿瘤转移和化疗耐药。

GPC-3与卵巢透明细胞癌预后不良密切相关，这些结果表明GPC-3是一个可靠的、极有希望的预后因素，而且可能成为卵巢透明细胞癌的一个新的分子治疗方案。

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10.3969/j.issn.1008-8849.2014.30.032

R737.31

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1008-8849(2014)30-3381-02

2013-10-10