高宇君，赵 敏，周艳喜，马学恩

（1．山西省太谷县畜牧兽医中心，太谷 030800；2．山西省晋中石羊饲料有限公司；3．内蒙古农业大学兽医学院）

疾病防控

绵羊、山羊内源肺腺瘤病毒启动子甲基化修饰检测

高宇君1，赵 敏2，周艳喜2，马学恩3

（1．山西省太谷县畜牧兽医中心，太谷 030800；2．山西省晋中石羊饲料有限公司；3．内蒙古农业大学兽医学院）

为分析绵羊和山羊内源性肺腺瘤病毒启动子甲基化修饰状况，参照绵羊、山羊内源性肺腺病毒gag基因上游非编码区序列CpG岛设计特异性甲基化引物，采用甲基化特异性PCR（MSP）方法检测了5只绵羊和5只山羊胎儿的肺脏、皮肤、血液基因组内源性病毒基因启动子区甲基化情况。结果表明：山羊和绵羊肺脏、皮肤、血液基因组中均存在甲基化和非甲基化的内源性肺腺瘤病毒启动子。

绵羊；山羊；启动子；甲基化；检测

DNA甲基化是遗传学修饰的一种重要形式，其主要特点是基因组可以通过对CpG序列的胞嘧啶进行甲基化修饰［1-2］，在DNA本身序列并不改变的条件下调控基因的表达。基因甲基化修饰调节蛋白表达是目前分子生物学研究的热点。检测基因启动子CpG岛甲基化状态可为从DNA水平上研究基因表达奠定基础［3-5］。基因中CpG丰富的区域被称为CpG岛，多种基因的启动子、基因复制的起始区和基因第一外显子都包含多个CpG岛。

根据目前的研究，动物基因组DNA中约有60%以上基因的启动子包含CpG岛［6］，并且CpG中有70%～80%胞嘧啶被甲基化修饰。脊椎动物基因组内的CpG含

量大约为42%。但甲基化胞嘧啶可以自发脱氨基而形成胸腺嘧啶，因此实际的CpG含量比预测分析的量少。内源肺腺瘤病毒（enJSRV）存在于绵羊、山羊等基因组内，检测发现内源性病毒启动子区和第一外显子前的非编码区内存在CpG岛。本研究用重亚硫酸盐对基因组DNA处理，并检测CpG岛在绵羊、山羊基因组内的存在情况，旨在对enJSRV甲基化和表达的关系进行探讨。

1 材料

1.1 动物

5只2 ～4月龄绵羊胎儿购于呼和浩特市某羊场，5只山羊组织样本购于呼和浩特市某屠宰场。采取绵羊和山羊的肺脏、皮肤、血液样本作为检测素材。

1.2 试剂

LA Taq DNA聚合酶、GC Buffer、dNTP、IPTG、X-gal、DNA Marker DL 15 000、pMD18-T等为宝生物工程有限公司产品，Tissue/Blood DNA提取试剂盒、凝胶回收试剂盒为天根公司产品，EpiTect Bisulfite Kit为凯杰生物技术有限公司产品。

1.3 主要仪器

包括电子天平（来多利斯科学仪器），PCR仪（Biometra），震荡仪（Thermo），迷你离心机（其林贝尔），凝胶成像系统（Sagecreation），电泳仪（Bio-Rad），离心机（Thermo），电热恒温水槽（上海森信实验仪器），全自动酶标仪（Bio-Tek），超纯水仪（Elga），恒温摇床（Tensus），制冰机（Graxt），微量移液器（Eppendor），-80℃超低温箱（Haier），超净工作台（Boxun），微波炉（格兰仕），等等。

2 方法

2.1 CpG岛扩增引物的设计

利用亚硫酸氢钠对基因组DNA处理后，DNA碱基发生改变，未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，DNA中甲基化的胞嘧啶转换为胸腺嘧啶。利用在线Methprmer软件设计引物，分别用来扩增绵羊、山羊内源性肺腺瘤病毒基因启动子处于甲基化状态和非甲基化状态的等位基因（见表1）。引物由Invitrogen公司合成。

表1 CpG岛扩增引物

2.2 基因组DNA提取和亚硫酸氢盐转化

在托盘上提取绵羊胎儿的肺脏、皮肤、血液组织。用液氮处理绵羊、山羊肺脏组织并研磨成粉末状，根据天根公司Tissue/Blood DNA提取试剂盒操作步骤提取绵羊和山羊基因组DNA，用0.5%的琼脂糖检测提取DNA，再将提取的DNA经紫外分光光度计检测浓度纯度。最后根据凯杰生物技术有限公司的EpiTect Bisulfite Kit试剂盒操作步骤，用亚硫酸氢盐转化各样品基因组DNA。将纯化的DNA溶液放-20℃冰箱保存。

2.3 绵羊、山羊enJSRV启动子区甲基化和非甲基化区扩增

以亚硫酸氢盐转化的DNA为模板，以OMSPF/MSPR、OUSPF/OUSPR、GMSPF/GSPR、GUSPF/GUSPR为引物进行PCR反应。反应体系：25 μL，LATaq DNA聚合酶0.25 μL，dNTP 4 μL，LA buffer 2.5 μL，灭菌水15.25 μL，上、下游引物各1 μL，模板基因组DNA1 μL。反应参数：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，退火30 s（4对引物退火温度依次为60℃、58℃、55℃、56℃），72℃延伸1 min，40个循环。72℃最后延伸5 min，4℃保存。进行2%琼脂糖凝胶电泳。

2.4 扩增基因序列测定

按照凝胶回收试剂盒操作步骤纯化PCR产物，将DNA洗脱于去离子水中。将纯化的PCR产物连接pMD18-T载体，反应体系：PCR回收产物 4.5 μL；pMD18-T载体0.5 μL，SolutionⅠ5 μL。16℃连接过夜。转化感受态细胞DH5a，涂Amp/IPTG/X-Gal固体LB平板37℃培养过夜，挑取白色菌落在LB培养液中过夜培养，作菌液PCR确定阳性克隆送北京三博公司测序。

2.5 基因序列分析

应用DNAStar、ClustalW2等生物软件对测得扩增片段进行分析，并对基因组转化序列一致性也进行分析。

3 结果与分析

3.1 PCR扩增目的片段

以亚硫酸氢盐转化的DNA为模板，以OMSPF/OMSPR、OUSPF/OUSPR、GMSPF/GMSPR、GUSPF/GUSPR为引物进行PCR反应，扩增的目的片段大小分别为121、118、107和107bp，与理论扩增的目的片段大小一致（见图1）。

3.2 扩增片段测序结果

MSP转化序列一致性是指基因组DNA经过亚硫酸氢盐处理之后，扩增得到的目的序列与原始基因组的一致性。4类扩增片段转化序列一致性很好，都在97%以上。绵羊肺腺瘤病毒启动子甲基化MSP转化序列一致性在98%以上。见表2。

图1 绵羊、山羊内源性病毒甲基化和非甲基化启动子扩增结果

表2 MSP转化序列一致性

3.3 组织中病毒启动子甲基化和非甲基化检测

以OMSPF/OMSPR、OUSPF/OUSPR、GMSPF/GMSPR、GUSPF/GUSPR为引物，以处理的基因组DNA为模板进行PCR反应。琼脂糖凝胶电泳显示，在绵羊所有组织中均检测出甲基化和非甲基化的病毒启动子。提取山羊组织DNA并检测，发现在山羊所有组织中均检测出甲基化和非甲基化的病毒启动子。

3.4 CPG岛检测

应用Methprmer对绵羊、山羊内源性肺腺瘤病毒启动子进行检测发现：绵羊内源性肺腺瘤病毒启动子区检测到的CpG岛大小为351 bp，设计引物扩增的目的片段包含13个CpG位点；山羊内源性肺腺瘤病毒启动子区检测到的CpG岛大小为271 bp，设计引物扩增的目的片段包含13个CpG位点。见图2。

图2 绵羊、山羊内源性病毒启动子区CpG岛

4 结论

绵羊、山羊组织基因组中均存在甲基化和非甲基化的内源性肺腺瘤病毒启动子，而绵羊和山羊的内源性肺腺瘤病毒启动子上都存在CpG岛。DNA甲基化是遗传学修饰的一种重要形式，在DNA本身序列并不改变的条件下调控基因的表达。徐萌杰等研究显示，在绵羊、山羊不同组织中都有内源性病毒表达，但表达量有所区别。由此推测，内源性绵羊和山羊的肺腺瘤病毒的表达可能与病毒启动子甲基化修饰存在一定相关性，但其关系需要深入研究。

［1］Amaravadi L，MJ Klemsz.DNA methylation and chromatin structure regulate PU.1 expression［J］.DNACell Biol，1999，18（12）：875-884.

［2］Lu Q.DNA methylation and chromatin structure regulate T cell perforin gene expression［J］.Immunol，2003，170（10）：5124-5132.

［3］Miller C A，S L Campbell，J D Sweatt.DNA methylation and histone acetylation work in concert to regulate memory formation and synaptic plasticit［J］.Neurobiol Learn Mem，2008，89（4）：599-603.

［4］Tai K Y.DNA methylation and histone modification regulate silencing of epithelial cell adhesion molecule for tumor invasion and progression［J］. Oncogene，2007，26（27）：3989-3897.

［5］Lu T Y.DNA methylation and histone modification regulate silencing of OPGduringtumorprogression［J］.CellBiochem，2009，108（1）：315-325.

［6］Li W.DNAmethylation and histone modifications regulate shoot regeneration in Arabidopsis by modulating WUSCHEL expression and auxin signaling［J］.PLoSGenet，2011，7（8）：e1002243.

Detection of DNA Methylation of JSRV Promoter in Sheep and Goat

GaoYu-jun，ZhaoMin，Zhou Yan-xi，et al
（Taigu Center for Animal Husbandryand Veterinary,Taigu 030800，Shanxi，China）

In order to investigate the DNA methylation of JSRV promoter in sheep and goat，the primers were designed according tothe sequence ofCpGisland ofgene gag’s upstreamregulation sequence.Genomic DNAin lung，skin and blood of5 sheep and 5 goats were extraced，and the DNAmethylation was detected byusingtechnique ofMSP.The results showed that both non methylation promoter and methylation promoter were found in lung，skin and blood in sheep and goats genomic DNA.

sheep；goat；promoter；methylation；detection

S826．2

A

2095-3887（2014）03-0045-03

10．3969/j．issn．2095-3887．2014．03．015

2014-03-19

高宇君（1968-），女，畜牧师。