任有蛇，白元生，杨子森，师周戈，刘晓妮，张春香

（1．山西农业大学动物科技学院，太谷 030801；2．山西省农业厅生态畜牧产业管理站）

遗传育种

3个绵羊群体MSTN基因编码区PCR-SSCP分析

任有蛇1，白元生2，杨子森2，师周戈2，刘晓妮2，张春香1

（1．山西农业大学动物科技学院，太谷 030801；2．山西省农业厅生态畜牧产业管理站）

采用PCR-SSCP技术分析了3个不同绵羊品种（杜泊绵羊、小尾寒羊、晋中绵羊）肌肉生长抑制素（MSTN）基因的单核苷酸多态性。根据3个绵羊品种MSTN基因Exon1（P1）、Exon2（P2和P3）和Exon3（P4和P5）序列设计5对PCR-SSCP引物并扩增，经SSCP分析，P1位点检测到A和B两个等位基因，AA、AB、BB三种基因型；且在晋中绵羊上处于Hardy-Weinberg平衡状态，而在小尾寒羊和杜泊绵羊上极显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态。P2和P5位点没有检测到多态位点。P3位点检测到A和B两个等位基因，AA、BB两种基因型；且在3个绵羊品种上极显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态。P4位点检测到A、B和C三个等位基因，AA、AB、AC三种基因型；且在小尾寒羊上处于Hardy-Weinberg平衡状态，在晋中绵羊上处于Hardy-Weinberg不平衡状态，在杜泊绵羊上极显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态。

MSTN；PCR-SSCP；等位基因；多态性

肌肉生长抑制素（MSTN）是转化生长因子TGF-β超家族的成员之一，是广泛存在于骨骼中的一种糖蛋白。McPherron等［1］首次用简并技术从小鼠肌肉组织中分离并发现MSTN是骨骼发育的负调控因子。2002年，Miranda等［2］研究发现在肉牛中该基因的3个外显子上有9个影响氨基酸序列的变异，其中6个可以导致双肌。引进的“双肌臀”型瘦肉猪的后躯表现出类似肉牛的双肌现象。Marcq等［3］分析了比利时德克塞尔“双肌”绵羊的可能遗传机制，发现与普通绵羊相比，MSTN基因的编码

区并没有碱基差异，于是推断影响MSTN表达的区域可能在C端或N端的非翻译区或内含子部分。顾志良等［4］发现了5个SNPs位于不同品种鸡MSTN基因5′和3′调控区。杨秀琴等［5］研究发现不同品种猪的MSTN基因5′调控区有一个T>A突变。毛亮等［6］研究获得了具有免疫原性的牦牛MSTN成熟肽，为提高牦牛产肉性能提供了理论依据。李绍华等［7］研究发现猪MSTN基因的第2、3外显子区域中均存在多态性位点。诸多研究结果表明，MSTN基因是影响肌肉发育及其相关性状的一个重要候选基因。因此，本研究以杜泊绵羊、小尾寒羊和晋中绵羊为研究对象，对其MSTN基因编码区进行PCR-SSCP分析验证，筛选多态性位点，以期为进一步探明MSTN基因对绵羊的高效选育和分子标记数据库的建立、种质资源保护与利用提供遗传学依据。

1 材料与方法

1．1 试验动物和基因组DNA制备

3个不同品种（杜泊绵羊、小尾寒羊、晋中绵羊）绵羊各30只，采集血样。按照常规苯酚-氯仿抽提法提取总DNA。

1．2 引物设计

按照NCBI数据库所公布的的绵羊MSTN基因序列（DQ530260.1）上Exon1、Exon2和Exon3的序列，利用Premier 5.0软件共设计了5对引物（见表1）。由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。

1．3 PCR扩增及产物检测

PCR扩增反应总体系为20 μL，其中10×PCR buffer 2 μL，dNTP 2 μL，上下游引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL，Taq酶0.5 μL，灭菌双蒸水13.5 μL。扩增条件：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s（30个循环）；72℃延伸5 min，4℃保存。取PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色检测扩增结果。回收纯化后由北京六合华大基因科技股份有限公司进行PCR产物序列测定验证。

1．4 PCR-SSCP分析

取2 μL PCR产物与8 μL上样缓冲液混匀，98℃变性10 min，立即冰浴10 min，用12%聚丙烯酰胺凝胶，120V恒压电泳5 h，染色，拍照。

1．5 统计分析方法

1.5.1 基因频率和基因型频率的计算 基因频率是指一个群体中某一基因对其等位基因的相对比率。

式中，Pi为第i个等位基因的频率；ii为纯合子等位基因；ij1，ij2，……ijn为与i共显的第1到n的等位基因。

基因型频率指一个群体中某一基因型占所有基因型的比率。

基因型频率=基因型个体数/测定的个体数

1.5.2 群体Hardy-Weinberg平衡状态的检验 用卡方检验的适合性检验进行检验。当df=1或理论次数小于5时，应采用矫正公式。

式中：Oi为实际观察值；Ei为理论值；n为等位基因数。

2 结果与分析

2．1 基因组DNA提取与PCR扩增

用核酸蛋白检测仪测定DNA浓度和纯度，OD260/OD280均在1.8左右。由图1可见，各引物PCR扩增大小与预期结果一致，扩增条带特异性强，可用于后续试验。

图1 MSTN基因PCR扩增结果

2．2 PCR-SSCP检测结果

从图2可知，P1位点出现A、B两个等位基因，AA、BB和AB三种基因型。由图3可知，P3位点共检测到A、B两个等位基因，AA、BB两种基因型。由图4可知，P4位点共检测到A、B、C三个等位基因，AA、AB和AC三种基因型。而P2和P5位点并没有检测到多态结果。

图2 引物P1的PCR-SSCP结果

图3 引物P3的PCR-SSCP结果

图4 引物P4的PCR-SSCP结果

2．3 MSTN基因不同位点的基因频率和基因型频率

对3个绵羊品种的MSTN基因P1多态位点进行了基因型检测，共检测到A、B两个等位基因和AA、BB、AB三种基因型。由表2可见，在杜泊绵羊中，A等位基因为优势基因，频率为0.616 7；晋中绵羊和小尾寒羊中A和B等位基因频率基本相似。就基因型分布来看，AA型在杜泊绵羊中的频率较高为0.500 0，BB型在晋中绵羊中的频率较高为0.500 0，AB型在小尾寒羊中的频率较高为0.466 7。卡方适合性检验结果表明，在P1位点晋中绵羊处于Hardy-Weinberg平衡状态，而在小尾寒羊和杜泊绵羊上极显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态。

对3个品种绵羊的MSTN基因P3多态位点进行了基因型检测，共检测到A、B两个等位基因和AA、BB两种基因型。其基因型频率和等位基因频率的分布见表3。由表3可见，在晋中绵羊和杜泊绵羊中A等位基因占优势，其等位基因频率分别为0.633 3和0.700 0。B等位基因在小尾寒羊群体上的频率高于晋中绵羊和杜泊绵羊。卡方适合性检验结果表明，在P3位点3个绵羊品种极显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态。

表2 不同MSTN基因P1位点的PCR-SSCP基因型频率和基因频率分布

表3 不同MSTN基因P3位点的PCR-SSCP基因型频率和基因频率分布

对3个绵羊品种的MSTN基因P4多态位点进行了基因型检测，共检测到A、B、C三个等位基因，AA、AB和AC三种基因型。由表4可见，在晋中绵羊、小尾寒羊和杜泊绵羊3个品种中，A等位基因为优势基因，尤其在小尾寒羊中频率为0.833 3。B等位基因在晋中绵羊和杜泊绵羊中频率相似。C等位基因在杜泊绵羊中的频率较其他两种绵羊要高。就基因型分布来看，AA型在小尾寒羊中的频率较高，而在杜泊绵羊中频率较低，仅为0.100 0。卡方适合性检验结果表明：在P4位点小尾寒羊处于Hardy-Weinberg平衡状态，晋中绵羊处于Hardy-Weinberg不平衡状态，杜泊绵羊极显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态。

表4 不同MSTN基因P4位点的PCR-SSCP基因型频率和基因频率分布

3 讨论

MSTN是肌肉的生长发育负向调控因子，是畜禽肉质性状的主要标记基因。张晓强等［8］对晋中绵羊、小尾寒羊和杜泊绵羊3个绵羊品种的MSTN基因进行克隆测序，在编码序列上共发现了4个氨基酸突变位点，其中杜泊羊MSTN第235（H→R）和251（S→F）位点氨基酸突变，小尾寒羊MSTN第343（T→A）突变，以及在晋中绵羊第282（C→R）氨基酸的突变。本研究是在这4个点突变基础上设计引物，用PCR-SSCP技术进一步验证这些突变，分析其基因型频率，以期发现与肉用性能相关的突变位点，结果显示3个绵羊品种P1位点（外显子1）有3种不同基因型AA、AB、BB，杜泊绵羊极显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态，AA基因型可能与杜泊羊肥育性能和肉品质好等优点相关。张慧玲等［9］在研究德国肉用美利奴绵羊MSTN基因外显子1时发现2种不同基因型GG和GA，该G位点可能与肉用性能相关。刘铮铸等［10］采用限制性内切核酸酶山羊MSTN基因的外显子3检测到3种基因型。Zhang等［11］用PCR-SSCP技术检测了安徽白山羊和波尔山羊MSTN基因外显子1上突变位点，该位点突变可能与生长发育相关。本研究的引物P4位点也在外显子3，检测到A、B和C三个等位基因和AA、AB、AC三种基因型；杜泊绵羊AC基因型频率显著高于小尾寒羊，杜泊绵羊群体中等位基因C频率显著高于其他两个群体。这说明在绵羊MSTN外显子3上可能存在与肉用性状相关的分子标记，但需进一步与性状关联分析，找到与生长发育和肉用性状相关的分子标记。

4 结论

杜泊绵羊Exon1上P1片段多态位点和Exon3上P4片段多态位点可能与生长发育相关。

［1］McPherron A C，Lawler A M，Lee S J.Regulation of skeletal musclemass inmice by a new TGF-βsuperfamily membe［J］.Nature，1997，387（6628）:83-90.

［2］Miranda ME，Amigues Y，Boscher MY，et a1.Simultaneous genotypingto detect myostatin gene polymorphism in beef cattle breeds［J］.Journal of Animal Breedingand Genetics，2002，119（6）：361-366.

［3］Marcq F，Elsen J M，El barkouki S.Investigating the role of myostatin in the determinism of double muscling characterizing Belgian Texel sheep［J］.Animal Genetics，1998（z1）.

［4］顾志良，张海峰，朱大海，等，鸡Myostatin基因的单核苷酸多态的群体遗传学分析［J］.遗传学报，2002，29（7）：565-570.

［5］杨秀芹，刘娣，李景芬，孙继权.猪Myostatin基因5’调控区的酶切多态性分析[J].东北农业大学学报，2002，33（3）：209-212.

［6］毛亮，徐亚欧，郑玉才，等.重组牦牛肌肉生长抑制素成熟肽的纯化及其免疫原性研究［J］.畜牧兽医学报，2012，43（8）：1210-1214．

［7］李绍华，熊远著，郑嵘，等.猪MSTN基因多态性及其SNPs的研究［J］.遗传学报，2002，29（4）：326-331．

［8］张晓强，姚继广，张春香.3个绵羊品种MSTN基因多态性的比较分析［J］.中国草食动物科学，2012，32（2）：14-17.

［9］张慧玲，史洪才，罗淑萍，等.绵羊肌肉生长抑制素基因外显子1单核苷酸多态性分析［J］.新疆农业大学学报，2007，30（4）：21-24.

［10］刘铮铸，李祥龙.我国主要地方山羊品种MSTN基因的MnlⅠ酶切多态性分析［J］.河南农业科学，2006，8：131-134.

［11］Zhang Z J，Ling Y H，Wang L J.Polymorphisms of the myostatin gene（MSTN）and its relationship with growth traits in goat breeds［J］.Genet Mol Res，2013，12（2）：965-971.

《中国草食动物科学》双月刊

《中国草食动物科学》是由中华人民共和国农业部主管、中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所主办的国家级科技核心期刊。于2012年4月由《中国草食动物》更名而成。《中国草食动物科学》为美国《化学文摘》（CA）收录期刊，中国科技核心期刊，中国农业核心期刊，RCCSE中国核心（扩展板）学术期刊；是中国科学引文数据库（CSCD）、中国科技论文与引文数据库、中国学术期刊综合评价数据库（CAJCED）和中国生物学文献数据库统计源期刊。

《中国草食动物科学》在原《中国草食动物》的基础上，立足西部，充分利用研究所的区位优势，提高期刊核心竞争力，建立适应市场经济体制的与国际接轨的全新办刊理念，及时、准确地反映草食动物科技进步的方向，增强在国内外同行中的影响力和竞争力，更好地满足广大科研、教学与畜牧生产者的需求，服务我国节粮型动物养殖和畜牧业发展。

《中国草食动物科学》主要刊登牛、羊、马、骆驼、鹿、兔、鸭、鹅、驼鸟、鱼等各种节粮型草食动物的最新科研成果和科技成就。主要栏目：遗传育种，繁殖与生理，营养与饲料，草地与牧草，疾病防控，专论与综述。

《中国草食动物科学》为双月刊，大16开，80页码，彩色封面，每期定价8．00元，全年48．00元，双月1日出版。国内统一刊号：CN 62-1206/Q，国际标准刊号：ISSN 2095-3887,邮发代号:54—57,国外代号:BM5133。全国邮局和本刊编辑部均可订阅。

地址：甘肃省兰州市七里河区硷沟沿335号 邮编：730050

电话：（0931）2656124 2115279 Email：xumuchj@163.com

PCR-SSCP Analysis on MSTN Gene in the Coding Region of Three Sheep Breeds

Ren You-she1，Bai Yuan-sheng2，ZhangChun-xiang1，et al
（1.College ofAnimal Science and Technology，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China；2.Shanxi Bureau ofAnimal Husbandryand Veterinary）

The single nucleotide polymorphisms of myostatin（MSTN）gene in the three sheep breeds（Dorper sheep，Small-tailed Han Sheep and Jinzhong sheep）were analysed in this paper.According to the sequences of Exon1（P1），Exon2（P2 and P3），Exon3（P4 and P5）ofMSTN gene in the sheeps，5 pairs ofPCR-SSCP primers were designed and amplified byPCR-SSCP，The results showed that there were 2 alleles and AA,AB and BB genotypes in P1.the P1 loci in Jinzhong sheep were consistent with the Hardy-Weinbergequilibriumand in the Small Tailed Han sheep and Dorper sheep were significantlydeviated fromit（P＜0.01）. Polymorphism was not detected in P2 and P5.There were 2 alleles and AA and AB genotypes in P3,and three sheep breeds were significantly deviated from the Hardy-Weinberg equilibrium（P＜0.01）.There were 3 alleles and AA，AB，and AC genotypes in P4.the P4 loci in the Small Tailed Han sheep were consistent with the Hardy-Weinbergequilibrium，in Jinzhongsheep not，and in Dorper sheep significantlydeviated fromit（P＜0.01）.

MSTN；PCR-SSCP；allele；polymorphism

S826．2

A

2095-3887（2014）03-0005-04

10．3969/j．issn．2095-3887．2014．03．001

2014-04-29

山西省肉羊联合育种科技合作项目

任有蛇(1970-)，男，副教授，博士。

张春香（1972-），女，副教授，博士，主要从事羊遗传育种与繁殖研究。