杨红远，洪琼花，权国波

（云南省畜牧兽医科学院，昆明650224）

雌激素对体外培养皮肤毛囊影响的研究

杨红远，洪琼花，权国波

（云南省畜牧兽医科学院，昆明650224）

为观察体外培养绵羊皮肤对外源雌激素加入后的反应，实验对新鲜皮肤、加入雌激素后培养的皮肤和对照组之间通过HE和免疫组化染色的结果进行了比较。结果表明：在HE染色中，加入0．5 μg/mL雌激素组和对照组之间没有差异，但是它们与新鲜皮肤相比均出现了皮肤结构的破坏；在免疫组化染色中，加入0．5 μg/mL雌激素组皮肤毛囊和皮脂腺普遍出现了凋亡现象，而对照组与新鲜皮肤组则无。表明0．5 μg/mL雌激素浓度将导致皮肤毛囊及皮脂腺的凋亡。

HE染色；免疫组化染色；毛囊；凋亡

羊毛是重要的畜牧业产品和工业原料，羊毛产量和质量不仅对畜牧生产效率有重要影响，而且在工业上也有重要的经济价值。环境应激能够明显调节皮肤内神经—内分泌—免疫反应［1］。毛发的生长受激素调节，而这常常与个体的年龄、发育或环境的变化同步。激素指导毛囊的内在变化，在下一个毛囊周期中使毛发类型与内外的变化相适应。外界的刺激如季节性的繁殖活动［2］、营养水平都能影响毛发类型［3］。人们早就有充分的证据证明雌激素通过它分布在皮肤中的受体对皮肤的各个结构产生直接的影响，因为性腺切除小鼠促进了毛囊生长期的加快［4］。近年来的研究表明，在小鼠皮肤的局部应用雌二醇会导致毛发生长的停止，并使毛囊加速进入退行期，如果拮抗了雌激素的作用，则小鼠的毛发又进入早期生长［5］。但是，雌激素对毛囊的作用机理人们了解尚不清晰，有待进一步研究。

1 材料与方法

1．1 材料来源

本实验所需绵羊皮肤取自昆明市易兴恒公司团结乡种羊场健康成年半细毛羊。剪去肩部羊毛后用碘酒、75%的乙醇消毒，手术刀切取皮肤，置于william’s E溶液（含青霉素400 IU/mL，链霉素100 μg/mL）中，带回实验室备用。

1．2 药品

1）对照无血清培养基：Williams E，胰岛素10 μg/mL，氢化可的松10 ng/mL，L-谷氨酰胺2 mmol/L，青霉素100 IU/mL，链霉素100 μg/mL。

2）加入雌激素无血清培养基：Williams E、胰岛素10 μg/mL，氢化可的松10 ng/mL，L-谷氨酰胺2mmol/L，青霉素100IU/mL，链霉素100μg/mL，雌激素0.5μg/mL。

3）培养体系为5%CO2、37℃、饱和湿度培养环境下的绵羊皮肤体外无血清漂浮式培养体系。

4）四孔板培养，皮肤大小为5 mm×5 mm。

本试验所用试剂，除非特别声明，均购自Sigma公司。

1.3 染色

1.3.1 HE染色 组织经固定—脱水—透明—浸蜡—包埋后切片，切片进行HE染色，封片。

1.3.2 凋亡抗体cl-caspase3的免疫组化染色 组织经固定—脱水—透明—浸蜡—包埋后切片，切片浸蜡、抗原修复后孵育1抗后4℃过夜，充分清洗后孵育2抗室温30 min，然后进行DAB染色，接着苏木素复染，用中性树胶封片。

1.4 仪器

体视显微镜：型号SZX9，日本生产；电子天平：型号BP3100S，德国生产；超纯水仪：MiLLi-Q，美国生产；高压灭菌器：型号SS245，日本生产；倒置荧光显微镜：型号IX-71，日本生产；超净工作台：型号BCM-1000，苏州苏净集团安泰公司生产；PH仪：型号828，美国生产。

2 结果

从HE染色的结果来看，新鲜皮肤毛囊成群分布，结构清晰紧凑，毛囊外周细胞核环形分布，且分布均匀紧致，真皮结构紧密，形态清晰。体外培养的皮肤与新鲜皮肤相比，其毛囊分布散乱，毛囊群结构明显受到了破坏，毛囊形态疏松，结构变化，毛囊外周细胞核分布松散，有扩散现象，真皮结构出现了松散现象，皮肤附属结构的层次越来越不规则。在培养皮肤的结构对比中，没有观察到有明显的差异，即体外培养皮肤在培养过程中具有相同的结构破坏的趋势，加入雌激素对这种退行性的变化没有可见的明显作用。见图1。

图1 3个实验组HE染色切片（a～c.100×，d～i.200×）

从免疫组化染色来看，0.5μg/mL雌激素加入培养体系后，毛囊出现了普遍的凋亡现象，凋亡主要出现在毛囊的内外根鞘上，而毛母质和毛乳头部分较少细胞凋亡。同时，在雌激素的作用下，皮脂腺也出现了细胞凋亡且主要发生在上皮细胞。没有加入雌激素的培养组其结果与新鲜皮肤的相一致，在毛囊和皮脂腺上均没有观察到细胞的凋亡。见图2。

图2 3个实验组cl-caspase3染色切片（a～c.100×,d～g,i.200×,h.400×,＊皮脂腺，褐色为细胞凋亡）

3 讨论

体外培养绵羊皮肤的培养过程中经历了结构逐渐破坏的过程，这从培养前后的真皮层、毛囊逐渐松散无序和细胞核逐渐弥散化都可以看出来，而这种结构的破坏解释了体外培养绵羊皮肤中RNA含量逐渐降低的部分原因，因为这种松散化的结果可能是细胞间信息通路的丧失，结构的破坏导致细胞对彼此之间和之外的信号接收能力下降，尽管作为个体而言是单个活细胞，但是因为无法启动基因的表达，不能执行其生物学功能，因此出现了培养皮肤的总RNA含量明显降低的现象。说明维持皮肤细胞间连接和正常组织结构需要来源于皮肤组织外的细胞因子等其他因素的参与。

从cl-caspase3染色的情况可以看出，0.5 μg/mL雌激素对体外培养绵羊皮肤毛囊有负面影响。这与Kondo等［6］发现雌激素对培养的人头皮毛囊有生长抑制作用的结果相似。本实验中这种负面作用主要是由于它引起了皮肤的附属结构毛囊和皮脂腺上的细胞凋亡。雌激素主要引起毛囊内外根鞘上的细胞凋亡，在毛母质和毛乳头中的凋亡要少于内外根鞘上，在皮脂腺上则是上皮细胞的凋亡。因此，推测这种凋亡现象与毛囊周期有很大的关系，因为Kovacs的实验证明雌二醇会导致毛囊进入退行期［5］。有研究发现，促乳素受体在毛囊的不同生长周期中具有显著的表达差异。哺乳动物毛发生长的季节性原因在于促乳素的调节［7］，它导致了动物的季节性换毛［8］。但是，雌激素可能也参与了毛囊周期的调控，并有可能是调控动物季节性脱毛的一个重要因素。至于在动物毛囊周期调控中有哪些激素及其它们的具体作用，还有待进一步的研究。同时，皮脂腺在雌激素刺激下的凋亡是一个值得注意的现象，这可能说明雌激素对毛囊周期的调控需要皮脂腺等皮肤附属结构的共同参与。

雌激素对不同的细胞具有不同的生理学作用，这可能是通过对不同受体阈值的调节实现的。因为雌激素的受体广泛存在于毛囊、表皮、毛乳头等细胞上，但是在相同浓度下却出现了不同的生理反应。

［1］Paus R，Theoharides T C，Arck P C.Neuroimmunoendocrine circuitryof the‘brainskin connection’［J］.Trends Immunol，2006，27：32-39.

［2］Lincoln G A，Richardson M.Photo-neuroendocrine control of seasonal cycles in body weight，pelage growth and reproduction:lessons from the HPD sheep model［J］.Comp Biochem Physiol Part C，1998，119：283-294.

［3］Johnson E.Seasonal changes in the skin of mammals［J］.Symp Zool Soc Land，1977，39：373-404.

［4］Johnson E.Qualitative studies of hair growth in the albino rat II.The ef fects ofsexhormones［J］.J Endocrinol，1958，16：351-359.

［5］Kovacs E J，Plackett T P，Witte P L.Estrogen replacement，aging，and cell-mediated immunity after injury［J］.J Leukoc Biol，2004，76(1): 36-41.

［6］Kondo S，Hozumi Y，Aso K.Organ cultured of human scalp hair foll-icules effect of testosterone and oestrogen on hair growth［J］.Arch Dermatol Res，1990，282：442.

［7］Nixon AJ，Ford CA.Regulation ofprolactin receptor expression in ovine skin in relation tocirculatingprolactin and wool follicle growth status［J］. Endocrinol，2002，172（3）：605-614.

［8］Lincoln G A，Clarke I J.Characterizing a mammalian circannual pace maker［J］.Science，2006，314：1941-1944.

Effect of Estrogen on Hair Follicles in Vitro

YangHong-yuan，HongQiong-hua，Quan Guo-bo
（AcademyofYunnan Animal Husbandryand Veterinary，Kunming650224，China）

This study was investigate to effects of exogenous estrogen on sheep skin cultured in vitro.The skin was divided into three groups：fresh，control and estrogen treated.H&E and immunohistochemical staining applied to each group.The results showed that，in H&E stain，there was nodifference between 0.5 μg/mLestrogen treated and control，both with skin structure damage compared with fresh skin;in immunohistochemical stain，0.5 μg/mLestrogen initiates apoptosis in hair follicles and sebaceous glands compared with the other twogroups.

H&E staining；immunohistochemical staining；hair follicle；apoptosis

S826．3

A

2095-3887（2014）03-0030-04

10．3969/j．issn．2095-3887．2014．03．009

2014-04-28

国家绒毛用羊产业技术体系 (CARS-40-06)；云南省科技计划项目( 2011FB131)

杨红远（1978-），男，硕士，助理研究员。

洪琼花（1968-），女，研究员，硕士生导师，从事动物遗传育种与繁殖工作。