何 阳，宋 沙，薛志杰，曹 晖，曹兵海

（1．中国农业大学动物科学技术学院，动物营养国家重点实验室，北京100193；2．秦宝牧业）

不同品种犊牛血清对3T3-L1前脂肪细胞增殖与分化的影响

何 阳1，宋 沙1，薛志杰1，曹 晖2，曹兵海1

（1．中国农业大学动物科学技术学院，动物营养国家重点实验室，北京100193；2．秦宝牧业）

试验以3T3-L1为模型细胞，通过研究不同品种犊牛血清对其增殖与分化的影响，为早期确定牛是否具有育肥价值提供一种新思路。选取50头秦和犊牛、50头安和犊牛和8头夏洛莱杂交犊牛，颈静脉取血制备血清。试剂盒检测细胞增殖相对数，油红0检测脂肪含量，用比色法测定三磷酸甘油脱氢酶（GPDH）和脂肪酸合成酶（FAS）活性。结果表明：①在细胞增殖方面，在增殖的第1天3个品种杂交牛无显著差异（P＞0．05）；在增殖的第2、4、6、8天夏杂牛极显著高于秦和牛（P＜0．01），显著高于安和牛（P＞0．05），而安和牛在第2天和第6天又极显著高于秦和牛（P＜0．05）；在增殖的第10天夏杂牛显著高于秦和牛（P＜0．05），而夏杂牛与安和牛、安和牛与秦和牛之间均无显著性差异（P＞0．05）。②在细胞分化方面，安和牛血清培养细胞分化的脂肪含量在第2、4、6、8、10、12天显著高于夏杂牛和秦和牛（P＜0．05）；秦和牛血清培养细胞分化的脂肪含量在第2、4、6、8、10天又显著高于夏杂牛（P＜0．05），第12天没有显著性差异（P＞0．05）。③分化第10天检测细胞内GPDH和FAS酶活性，安和牛血清培养的细胞组中的GPDH极显著高于夏杂牛（P＜0．01）和秦和牛（P＜0．01）,FAS活性极显著高于夏杂牛（P＜0．01），显著高于秦和牛（P＜0．05）；夏杂牛血清培养的细胞组中的GPDH显著高于秦和牛（P＜0．05），而FAS的活性两者间没有显著性差异（P＞0．05）。结果显示：牛血清品种是影响前脂肪细胞增殖与分化的因素，夏杂牛血清更有利于前脂肪细胞的增殖，而安和牛血清更有利于前脂肪细胞的分化，但作为确定牛是否具有育肥价值仍需进一步研究。关键词：犊牛血清；3T3-L1前脂肪细胞；增殖与分化

建立在肉牛生长发育早期就能快速、准确地检测与评估肉牛育肥效果及牛肉品质的方法，是提高生产效率、准确满足消费者的肉质需求、提高产业效益的途径之一。为达到这一目的，已用超声波活体测定背膘厚和眼肌面积［1］，并在牛肉的大理石纹和嫩度的基因标记［2］等技术领域进行研发应用。

肌间脂肪组织是影响牛肉品质的重要因素之一，前脂肪细胞的分化活性又是影响脂肪组织发育的决定因素，而前脂肪细胞的分化活性一般受脂肪酸合成酶（FAS）、三磷酸甘油脱氢酶(GPDH)、过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARS）等因素的影响［3-5］。在有关前脂肪细胞分化活性的研究中，一般将3T3-L1前脂肪细胞系作为标准模型细胞，如研究肥胖、糖尿病的模型细胞［6-7］，在培养基中添加各种物质用以研究脂肪合成代谢的机理［8-11］，但几乎所有研究所使用的培养基都含有血清，说明血清是影响前脂肪细胞分化的重要因素［12］。血清中含有细胞生长所必需的营养成分，这些成分在体外可以再造适于细胞生长、繁殖、黏附和分化的生理环境［13］，决定细胞的生长效果［14］。不同品种的胎牛血清对细胞增殖有影响［12］，说明牛的血清成分对前脂肪细胞分化活性的影响在品种间有差异，由此推测血清成分的活性很可能受品种遗传性能支配，继而影响前脂肪细胞的分化活性，从而影响牛肉中的脂肪沉积效果。如果这个推断成立，则使用不同品种的犊牛血清培养3T3-L1前脂肪细胞标准模型，就有可能鉴别各品种牛的前脂肪细胞的分化活性，从而对肉牛的牛肉品质在生长早期做出鉴别提供另一种思路。

为此，本试验采用3T3-L1前脂肪细胞作为模型细胞，用不同品种牛血清作用于细胞，研究了不同品种犊牛血清对前脂肪细胞增殖与分化的影响。

1 材料与方法

1．1 试验材料

3T3 -L1前脂肪细胞购自国家细胞资源中心。犊牛血清采自陕西秦宝牛场的108头牛，所有牛都在5～7月龄,其中秦川牛与和牛杂交牛（秦和牛）50头，安格斯牛与和牛杂交牛（安和牛）50头，夏洛莱杂交牛（夏杂牛）8头。对试验牛颈静脉采血，4℃下3 000 r/min离心10 min（上海安亭），取血清于-20℃冰箱（中科美菱）保存待测。试验所用试剂除特殊说明以外均购于Sigma。

1．2 试验方法

1.2.1 血清的处理 将-20℃保存的血清放在4℃下解冻，每管中取一部分直接用0.22 μm微孔过滤器（Pall）过滤待测。

1.2.2 前脂肪细胞的分化培养 将汇合成单层的3T3-L1细胞消化，以104细胞/mL密度将细胞悬液接种到96孔板中。汇合2 d后换用含胰岛素10 mg/L，地塞米松1 μmol/L，1-甲基-3-异丁基黄嘌呤0.5mmol/L，10%不同牛血清的诱导培养基（分化第0天），分化第2天换用含胰岛素10 mg/L、10%不同牛血清的分化培养基，第4天以后换用含10%不同牛血清的DMEM基础培养基（北京索莱宝生物科技有限公司），每2天换1次液。油红0（北京经日今典）染色法测定细胞内脂肪含量［15］,用酶标仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司）在540 nm波长下的吸光度（OD值）表示脂肪含量。

1.2.3 前脂肪细胞的增殖 将汇合成单层的3T3-L1细胞消化，以103细胞/mL密度将细胞悬液接种到96孔板中。以后换用DMEM基础培养基（10%不同牛血清），每两天换1次液。用CCK-8试剂盒在37℃孵育4 h后用酶标仪在450 nm波长下测得的吸光度作为细胞相对数量。

1.2.4 三磷酸甘油脱氢酶（GPDH）活性测定 弃去培养液，用PBS缓冲液（北京索莱宝科技有限公司）冲洗两遍，加入冰蔗糖（北京广达恒益）缓冲液1 mL/孔，用超声波细胞破碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）破碎成匀浆30 s。将匀浆液转移至1.5 mL离心管中。匀浆液在4℃，3 000 r/min离心5 min，吸取上层清液即为分析用液；测定过程参照Wise等[16]方法进行。蛋白浓度采用考马氏亮蓝蛋白定量试剂盒（南京建成生物工程研究所）测定。1U酶活相当于氧化1nmol的NADH/min，以此代表分化能力。

1.2.5 脂肪酸合成酶（FAS）活性测定 在周长海等［17］测定的基础上，做了如下修改。加入11.05 mmol/Lβ-NADPH溶液0.04 mL，7.25 mmol/L乙酰辅酶 A溶液0.04 mL，40℃的Cook-tail Solution缓冲溶液1.4 mL，上清液0.08 mL，混合均匀后，再加入3.51 mmol/L丙二酸单酰辅酶A溶液0.08 mL，迅速震动混合后，用紫外分光光度计（日本岛津制作所）在340 nm条件下测1 min吸光度变化。蛋白浓度采用考马氏亮蓝蛋白定量试剂盒测定。1U酶活相当于氧化1 nmol的NADPH/min，用来代表分化能力。

1．3 统计学分析

本试验中的所有数据都以平均数±标准差来表示。用EXCEL2007软件对数据进行初步统计；用SAS V9.0 for windows软件对数据进行GLM单因素方差分析，用Duncan氏法多重比较平均值之间差异的显著性。差异性显著水平为P＜0.05。

2 结果与分析

2．1 不同品种犊牛血清对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响

由表1可见，随着细胞培养天数的增加，细胞数量呈“S”形增长。在增殖的第1天，3个品种杂交牛细胞数量无显著差异（P＞0.05）；在增殖的第2、4、6、8天夏杂牛极显著高于秦和牛（P<0.01），显著高于安和牛（P<0.05），而安和牛在第2天和第6天又极显著高于秦和牛（P<0.01）；在增殖的第10天夏杂牛显著高于秦和牛（P<0.05），而夏杂牛与安和牛、安和牛与秦和牛之间均无显著差异（P＞0.05）。

表1 不同品种犊牛血清对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影晌

2．2 不同品种犊牛血清对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响

由表2可见，随着细胞分化培养天数的增加，细胞内合成脂肪的量逐渐增加。在分化前期（2 d），细胞的脂肪合成量以安和牛>秦和牛>夏杂牛的顺序表现显著差异（P<0.05）。在分化后期（10～12 d）夏杂牛的脂肪合成量大于秦和牛但小于安和牛。安和牛血清培养细胞分化的脂肪含量在第2、4、6、8、10、12天显著高于夏杂牛和秦

和牛（P<0.05）；秦和牛血清培养细胞分化的脂肪含量在第2、4、6、8、10天又显著高于夏杂牛（P<0.05），第12天没有显著性差异（P>0.05）。

表2 不同品种犊牛血清对3T3-L1前脂肪细胞分化的影晌

2．3 不同品种犊牛血清对3T3-L1前脂肪细胞中GPDH和FAS活性的影响

由表3可见，由于脂肪细胞合成脂肪最快时期是第8天以后，所以在分化的第10天检测细胞液中GPDH和FAS的活性。安和牛血清培养的细胞组中的GPDH活性极显著高于夏杂牛（P<0.01）和秦和牛（P<0.01），FAS的活性极显著高于夏杂牛（P<0.01），显著高于秦和牛（P<0.05）；夏杂牛血清培养的细胞组中的GPDH显著高于秦和牛（P<0.05），而FAS的活性两者间没有显著性差异（P>0.05）。

表3 不同品种犊牛血清对3T3-L1前脂肪细胞中GPDH和FAS活性的影响U

3 讨论

3．1 不同品种犊牛血清对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响

血清影响细胞的形态、生长情况、细胞传代及冻存各方面，研究认为不同胎牛血清对细胞增殖有影响［12］。秦安牛血清与秦川牛血清相比，秦安牛血清可能有利于细胞的增殖[18]。本试验中，夏杂牛血清比安和牛和秦和牛血清更有利于细胞的增殖，而安和牛血清又比秦和牛血清更有利于细胞的增殖，说明所测3个牛种犊牛血清中的某些成分具有独自的促脂肪细胞增殖能力，其中在三磷酸甘油脱氢酶活性上，5～7月龄的夏杂牛高于其他两种牛，而安和牛又高于秦和牛。

3．2 不同品种犊牛血清对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响

前脂肪细胞分化过程中的一个显著性标志是细胞中逐渐沉积大量的脂肪。有研究认为，猫血清比胎牛血清更能促进大鼠前脂肪细胞及3T3-F442A细胞的分化［19］；血清能促进猪脂肪细胞内脂肪的沉积［20］。冯丽萍等［18］报道，秦川牛血清比秦安牛血清可能更有利于细胞的分化。在本试验研究中，安和牛血清比秦和牛血清和夏杂牛血清更能促进3T3-L1细胞的分化，而秦和牛血清又比夏杂牛血清更能促进3T3-L1细胞的分化。从3T3-L1细胞模型推测，安和牛脂肪沉积要比秦和牛和夏杂牛快，秦和牛脂肪沉积又比夏杂牛快。张国梁等[21]的育肥结果也证实了本研究的研究结果。

3．3 不同品种犊牛血清对3T3-L1前脂肪细胞中GPDH和FAS活性的影响

细胞分化过程会编码大量与脂肪合成有关的酶类，其中GPDH、FAS是分化晚期的标志物[22]，晚期标志物活性的强弱表示前脂肪细胞分化活性的强弱，它的出现标志着脂肪细胞的生长和生成。研究认为在细胞分化过程中与脂肪合成有关的酶不仅在数量上增加，而且促进细胞合成新的、热稳定的GPDH,并且GPDH的活性会上升600多倍[16]。研究认为猫血清比胎牛血清培养的大鼠前脂肪细胞及3T3-F442A细胞的中GPDH和FAS活性高。本试验结果显示，安和牛血清培养细胞中的GPDH最高，这与细胞合成脂肪的量相符合。虽然秦和牛血清组培养细胞合成脂肪量比夏杂牛大，但在分化后期夏杂牛血清组合成脂肪速度比秦和牛血清组快。说明夏杂牛血清组中GPDH活性比秦和牛血清组高。在脂肪合成过程中，首先是乙酰辅酶-A经过7次酶促反应合成棕榈酸，FAS是这7个酶促反应的脂肪酸合成酶系［23］。在3T3-L1前脂肪细胞向脂肪细胞分化过程中细胞中的FAS活性升高可达19.5倍，并稳定在12.5倍［24］。在本试验中，FAS的活性与脂肪合成量存在正相关关系，安和牛血清组的细胞中FAS及GPDH的活性最高，使得细胞中合成的脂肪量最高。

4 结论

夏杂牛血清比安和牛血清和秦和牛血清更能促进细胞的增殖，而安和牛血清比夏杂牛血清和秦和牛血清更能促进细胞的分化，秦和牛血清的促增殖和分化能力介于夏杂牛血清和安和牛血清之间。但这种通过细胞培养的方法作为确定牛是否具有育肥价值仍需进一步研究。

致谢：感谢在陕西秦宝采样时，牛场所有工作人员对采样的支持和帮助！

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国家肉牛牦牛产业技术体系(CARS-38)；南方地区草食家畜育肥与高品质肉生产技术研究(201303144)

何阳（1987-），硕士生。

曹兵海，博士生导师，主要从事肉牛营养与肉品质研究。