马亦良，黄 娟，白 军

（1.深圳市宝安区妇幼保健院，广东深圳518133；2.杭州市红十字会医院妇产科，浙江杭州31003）

胎盘细胞凋亡与早产流产关系研究

马亦良1，黄 娟1，白 军2*

（1.深圳市宝安区妇幼保健院，广东深圳518133；2.杭州市红十字会医院妇产科，浙江杭州31003）

目的研究早产流产与胎盘细胞凋亡关系及其可能机制。方法随机选取正常妊娠足月分娩胎盘30例，早产胎盘30例，流产胎盘30例，取胎盘组织制备单细胞悬液，FCM检测胎盘细胞的凋亡率；DNA琼脂糖电泳检测胎盘细胞的凋亡特征性DNA条带；westernblot检测细胞凋亡相关蛋白表达。结果早产和流产胎盘细胞的凋亡率，明显高于正常妊娠分娩的胎盘细胞的凋亡率（P＜0.05）；同时琼脂糖凝胶电泳出现典型的凋亡细胞DNA梯形条带，伴随着bcl－2蛋白表达下调，bax、cyt－c、caspase－9和caspase－3蛋白表达上调，bcl－2／bax比值下降。结论早产流产可能与胎盘细胞启动线粒体途径凋亡密切相关。

早产；流产；凋亡；线粒体途径

流产（abortion）是指妊娠不足28周，胎儿体重不足1000g而终止者［1］；早产（premature delivery）是指妊娠满28周至不足37周间分娩者［2］，早产和流产不仅给患者带来生理上精神上的伤害，还伴有沉重的经济负担，有的甚至导致流产后不孕不育，早产流产后抑郁等疾患。既往研究认为早产流产原因为染色体异常、免疫异常，目前研究认为流产和早产与胎盘细胞凋亡密切相关，胎盘细胞凋亡可以引起多种妊娠合并症［3］，为此本研究探讨早产流产与胎盘细胞凋亡的关系及其可能的分子生物学机制。

1 资料与方法

1.1 研究对象

实验标本来源于2012－10～2013－10于深圳市宝安区妇幼保健院产科足月妊娠分娩胎盘组织30例（分娩过程中未使用药物处理），流产患者胎盘组织30例（入院诊断为难免流产，未使用药物保胎），早产胎盘组织30例（入院诊断为难免早产，未使用药物保胎），排除高血压、糖尿病等妊娠合并症，排除癫痫等神经系统疾病，排除母儿血型不合等免疫系统疾病，诊断标准参照第七版妇产科学［4］。

1.2 标本采集

所有的胎盘组织标本均在手术室，于无菌状态下切取，共3份，每份大小约1 cm×l cm×l cm，均用4℃的PBS清洗2次。用眼科剪反复剪碎组织块后，用200目尼龙网过滤2次，制成单细胞悬液，备用。

1.3 仪器与设备

流式细胞仪为美国Coulter公司生产的Epics－XL型，结果采用Multicycle软件分析。垂直电泳仪和电泳槽为美国BIO－RAD公司产品，结果采用Alpha Imager 2200软件分析。

1.4 FCM检测胎盘细胞凋亡率

计数各组胎盘组织细胞，分别取约含1×106细胞悬液，用PBS清洗2遍后，加入4℃的75％乙醇混匀固定，4℃过夜后PI避光染色30min，进行流式细胞仪检测［5］，以上实验重复3次。

1.5 DNA琼脂糖凝胶电泳检测胎盘细胞凋亡

取上述各组胎盘组织细胞，加入细胞裂解液裂解，离心、除沉，加RNA酶，提取细胞DNA，取10μg定量样品与适量加样缓冲液混匀后，用1.5％琼脂糖凝胶在50V恒压下电泳，EB染色，紫外透射反射仪下检测，并用自动成像系统（Polaroid）拍照［6］。

1.6 western blot检测胎盘细胞凋亡相关蛋白表达

取各组胎盘组织细胞，加入细胞裂解液冰面裂解提取蛋白，取30μg定量样品用SDS－PAGE电泳分离后将蛋白转移至PVDF膜上，再用5％脱脂牛奶－TBST室温摇床封闭2 h，一抗于37℃孵育3 h，二抗于37℃孵育1 h，ECL发光剂激发荧光，压片显影定影［8］。结果用灰度扫描仪处理分析。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 FCM检测早产流产胎盘组织细胞凋亡率

正常妊娠足月分娩胎盘组织细胞、早产胎盘组织细胞、流产胎盘组织细胞均有凋亡发生，凋亡率分别为5.88％、15.64％和27.32％，早产胎盘组织细胞与流产胎盘组织细胞凋亡率明显高于正常分娩族，个组间比较差异有统计学差异（P＜0.01），见图1。

图2 FCM检测早产流产胎盘细胞凋亡率

2.1 DNA琼脂糖凝胶电泳检测早产流产胎盘组织细胞凋亡

凋亡特异性的生化特征是核DNA在核小体连接处被切断，形成180～200 bp或其整数倍大小的DNA片段，在琼脂糖凝胶电泳上表现为梯状条带。本研究结果显示早产流产胎盘细胞DNA琼脂糖电泳均出现了典型的梯状条带，而正常分娩的胎盘细胞梯形条带不明显，可能与足月分娩胎盘细胞发生凋亡数量少有关。本研究结果进一步证实了早产流产胎盘细胞明显发生凋亡，见图2。

图2 DNAladder检测早产流产胎盘细胞凋亡

2.3 Western blot检测流产早产胎盘组织细胞凋亡相关蛋白表达

早产和流产胎盘组织细胞的bcl－2蛋白表达下调，与正常妊娠足月分娩胎盘组织细胞比较，组间差异有统计学意义（P＜0.05）；早产和流产胎盘组织细胞的Bax、Cyt－c、Caspase－9和Caspase－3蛋白表达上调，与正常妊娠足月分娩胎盘细胞蛋白比较，组间差异有统计学意义（P＜0.05）；而且bcl－2／Bax比值，早产流产组明显高于正常妊娠足月分娩组（P＜0.05）。见图3。

图3 Western Blot检测早产流产胎盘细胞凋亡相关蛋白表达

3 讨论

早产和流产是妇产科临床常见的一种多发病和常见病，长期以来给孕产妇的身心健康带来巨大的痛苦，也是一直困扰妇产科临床工作者的主要问题［1，2］。既往研究认为早产流产原因为胚胎因素、母体因素、免疫异常和环境因素；对早产的原因多集中在子宫畸形，生殖道感染，妊娠合并症和并发症上，目前有研究表明早产和流产与胎盘细胞凋亡密切相关，胎盘细胞凋亡可以引起多种妊娠合并症［1，2］，为此本研究探讨早产流产与胎盘细胞凋亡的关系及其可能的分子生物学机制。

细胞凋亡是由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡，是细胞的一种程序性死亡的形式之一，凋亡与生物胚胎发生发育，成熟细胞新旧交替，激素依赖性生理退化，自身免疫性疾病，肿瘤的发生发展有密切的联系。凋亡是多因素、多阶段和多基因严格控制的过程，现在研究细胞凋亡控制途径主要有两条，一条是死亡受体介导的外源性凋亡通路，另一条是线粒体途径介导的内源性凋亡通路［5］。Bcl－2家族成员通过调控线粒体信号转导系统而调控内源性凋亡途径，其中Bcl－2蛋白和Bax蛋白是Bcl－2家族成员中两个重要的成员，共同组成调控Cyt－c的释放通道，Bcl－2蛋白具有抑制Cyt－c释放的功能，而Bax则促进Cyt－c释放，Bcl－2／Bax决定了线粒体外膜的通透性和阻止细胞色素c的释放的量［6，7］；Cyt－c是细胞线粒体凋亡途径的关键，Cyt－c进入胞浆后，即与Apaf－1、ATP／dATP结合成凋亡体复合物［8］，凋亡体复合体进而激活caspase－9蛋白，而caspase－9蛋白可以通过水解caspase－3前体蛋白［9］，激活caspase－3蛋白，而caspase－3蛋白是细胞凋亡的执行者，它可以直接降解细胞内的结构蛋白和功能蛋白引起细胞凋亡，可以使细胞质、细胞核、细胞骨架的重要蛋白降解失活，而导致细胞发生凋亡［10］。本研究表明，早产和流产的患者，其胎盘组织细胞出现大量凋亡，与正常妊娠足月分娩的胎盘组织细胞相比，差异有明显的统计学意义（P＜0.05）；同时调控内源性凋亡途径的线粒体途径的关键蛋白Bcl－2表达下调，而Bax、Cyt－c、Caspase－9和Caspase－3蛋白表达上调，同时Bcl－2／Bax比值降低，提示早产和流产可能与胎盘细胞启动内源性线粒体凋亡途径引起胎盘组织细胞凋亡相关。

综上所述，早产和流产的发生与发展与胎盘组织细胞凋亡有密切的关系，随着妊娠的进展，胎儿及胎盘组织也相互成比例相适应的生长而渐趋增大，在此期间，胎盘组织细胞始终处于内外各种因素的刺激下，若胎盘细胞在各种因素刺激下发生凋亡过多，就会使具有功能效用胎盘细胞数量减少，不能满足胎儿需要的时候，就会导致早产流产，这提示胎盘细胞发生凋亡以及发生凋亡的细胞数量可能与早产流产的发生有关，阻止抑制胎盘细胞的凋亡有助于减少早产流产的发生，这为我们从生物医学角度治疗早产流产提供了理论依据，但是相关研究还待继续深入，尤其是胎盘组织细胞发生凋亡其它机制的进一步探讨。

［1］Wei D，Wu Q，Shi H.Apoptosis and p53 expression in the placental villiof females with unexplained recurrent spontaneous abortion［J］.Exp Ther Med，2014，7（1）：191－194.

［2］Engelstad HJ，Roghair RD，Calarge CA，et al.Perinatal Outcomes of Pregnancies Complicated by Maternal Depression with or without Selective Serotonin Reuptake Inhibitor Therapy［J］.Neonatology.2013，105（2）：149－154.

［3］Stenqvist AC，Nagaeva O，Baranov V，et al.Exosomes Secreted by Human Placenta Carry Functional Fas Ligand and TRAIL Molecules and Convey Apoptosis in Activated Immune Cells，Suggesting Exosome－Mediated Immune Privilege of the Fetus［J］.J Immunol.2013，191（11）：5515－5523.

［4］乐杰，谢幸，林仲秋，等.妇产科学［M］，北京：人民卫生出版社，2010，83－89.

［5］Terada T.Smooth muscles and stem cells of embryonic guts express KIT，PDGFRRA，CD34 and many other stem cell antigens：suggestion that GIST arise from smooth muscles and gut stem cells［J］.Int JClin Exp Pathol，2013，6（6）：1038－1045.

［6］Shionome Y，Lin WH，Shiao HY，et al.A novel aurora－A inhibitor，BPR1K0609S1，sensitizes colorectal tumor cells to 5－fluorofracil（5－FU）treatment［J］.Int J Biol Sci， 2013，9（4）：403－411.

［7］Hsieh TC，Wu JM.Regulation of cell cycle transition and induction of apoptosis in HL－60 leukemia cells by the combination of Coriolus versicolor and Ganoderma lucidum［J］.Int JMolMed，2013，32（1）：251－257.

［8］Hescot S，Slama A，Lombès A，et al.Mitotane alters mitochondrial respiratory chain activity by inducing cytochrome c oxidase defect in human adrenocortical cells［J］.Endocr Relat Cancer，2013，20（3）：371－381.

［9］Young Park S，Jeong YJ，Kim SH，etal.Epigallocatechin gallate protects against nitric oxide－induced apoptosis via scavenging ROSandmodulating the Bcl－2 family in human dental pulp cells［J］.J Toxicol Sci，2013，38（3）：371－378.

［10］Tenore GC，Manfra M，Stiuso P，et al.Polyphenolic pattern and in vitro cardioprotective properties of typical red wines from vineyards cultivated in Scafati（Salerno，Italy）［J］. Food Chem，2013，140（4）：803－809.

The relationship between premature delivery／abortion and apoptosis of placental cells

MA Yi-liang1，HUANG Juan2，BAI Jun3
（1.Shenzhen Baoan District Maternal and Child Hospital，Shenzhen 518133，China；

ObjectiveThe aim of this study is to investigate the relationship between premature delivery／abortion and apoptosis of placental cells viamitochondrial way and its possiblemolecularmechanism.M ethods30 placenta of term delivery，30 placenta of premature delivery，and 30 placenta of abortion were selected randomly.The suspension of single placental cells wasmade，and apoptosis rate of placental cells was detected by FCM，the laddershaped band was detected by DNA agarose gel electrophoresis，the expression of apoptosis related proteins was assessed by western blot.ResultsThere was significant difference in apoptosis of placental cells between premature delivery／abortion，compared with term delivery group（P＜0.05）.DNA agarose gel electrophoresis showed the typical ladder－shaped band of apoptosis，accompanied by the down－regulation of Bcl－2 protein，and the up－regulation of Bax，Cyt－c，Caspase－9 and Caspase－3 protein，and the ratio of Bcl－2／Bax decreased.ConclusionPremature delivery／abortion may be related to triggering placental cells apoptosis via themitochondrial pathway.

premature delivery；abortion；apoptosis；mitochondrial pathway

R74.21

A

1672－2639（2014）01－0022－042.Department of Obstetric and Gynecology，Hangzhou Red Cross Hospital，Hangzhou，310003，China）

2014－01－06；责任编辑 赵菊梅］

*

白 军，Email：szbamyl2013＠126.com