解雁飞，李 颖，李红梅

（延安大学附属医院产科一病区，陕西延安716000）

水通道蛋白-9和Caspase3在胎膜组织中的表达及与羊水过少的相关性研究

解雁飞，李 颖，李红梅

（延安大学附属医院产科一病区，陕西延安716000）

目的探讨水通道蛋白－9（AQP－9）和凋亡蛋白Caspase3在羊水过少产妇和羊水量正常的产妇胎膜中的表达差异。方法采用免疫组化方法（SP法）分别检测30例羊水过少和30例羊水量正常产妇胎膜组织中AQP－9和Caspase3的蛋白表达水平，并分析这两种蛋白的表达强度。结果AQP－9和Caspase3蛋白在实验组与对照组产妇的胎膜中均有阳性表达。实验组胎膜中的AQP－9蛋白表达水平明显比对照组低，Caspase3的表达却明显比对照组高，而两者的表达差异均有统计学意义（P＜0.05）；同时AQP－9与Caspase3在羊水过少组胎膜细胞中的表达却呈负相关（r＝－0.72，P＜0.05）。结论羊水过少组孕妇胎膜中AQP－9蛋白的低表达与Caspase3蛋白的高表达，提示AQP－9和Caspase3在产妇胎膜中的异常表达可能是羊水过少发生的原因之一。

羊水过少；胎膜；水通道蛋白；凋亡蛋白；免疫组织化学

羊水是羊膜腔中的液体，胎儿在羊水中活动并生长发育。临床上将妊娠晚期也就是妊娠超过28周而羊水量少于300 ml者称为羊水过少。羊水量减少会使宫缩时子宫与胎儿之间的缓冲减少，脐带也容易受压，使胎儿发生宫内缺氧率大大增加［1］；同时羊水过少时胎肺膨胀受阻影响胎肺的发育，更容易发生新生儿窒息［2］。目前仍有一部分羊水过少的病因尚不明确，因此研究羊水平衡的调控对预防、诊断和治疗羊水过少有着重要意义。羊水的生成与吸收所构成的平衡决定着羊水量的正常与否。近年来AQP在孕妇胎盘胎膜上的分布及其与羊水调节关系的研究已逐渐被国内外学者所重视。研究发现在胎盘胎膜上只有AQPl、3、8、9的表达，而Caspase3作为一种凋亡因子，可调控胎膜中多种细胞的凋亡，可能与羊水过少的发生有关。因此研究水通道蛋白9与Caspase3调控胎膜两侧羊水平衡及其与羊水量异常的关系目前广受关注。本研究运用免疫组化的方法检测AQP9和Caspase3在羊水量正常组和羊水过少组孕妇胎膜中的表达差异及探讨其与羊水过少之间的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2013－06～2013－09在延安大学附属医院产科足孕月（37～41周）剖宫产分娩的羊水过少组产妇及正常组产妇各30例（羊水过少组初选入组为43例，剔除13例；正常组初选入组为45例，剔除15例），两组孕妇年龄、孕周、孕次和胎膜重量等均无显著性差异，既往无内外科合并症及其他妊娠合并症（妊娠期高血压疾病、胎膜早破、胎儿宫内生长受限、胎儿畸形及其他并发症，近期无药物服用史，感染及母体脱水等因素。羊水正常组剖宫产的指征有前次剖宫产，头盆不称。产前超声检测羊水指数（amniotic fluid index，AFI）≤5.0 cm为羊水过少，羊水指数5～9 cm为临界性羊水过少。剖宫产术中进一步核实羊水量，羊水总量＜300 m l确诊为羊水过少。如果术中羊水量和术前羊水指数不相符，该病例予以剔除。

1.2 标本采集和标本选择

所有研究对象行选择性剖宫产后，在胎盘娩出后5 min内立即取一份胎膜组织，然后用无菌生理盐水漂洗干净去除血液，置于4％的中性甲醛中固定24 h后进行石蜡包埋。

1.3 研究方法与结果

1.3.1 免疫组化方法本实验操作步骤严格按照说明书进行：将采集并制成的石蜡包块标本切成厚约5μm的切片，经常规脱蜡水化后，滴加新鲜配置的3％H2O2进行封闭；用枸橼酸盐缓冲液高压修复后，分别加入稀释的AQP9－抗兔抗人工作液（北京博奥森生物有限公司），4℃冰箱中过夜；滴加生物素标记的兔抗山羊IgG二抗工作液，37℃孵育10 min；滴加HRP标记链霉卵白素工作液，37℃孵育10 min；用二氨基联苯胺（DAB）溶液显色，显微镜下观察，控制显色程度；淡苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。采用PBS缓冲溶液代替一抗作为阴性对照。

1.3.2 结果判定 以镜下在细胞内看到棕色或黄色颗粒者作为判定阳性细胞的标准。每张切片在高倍镜（×400）视野下，随机选取5个视野，观察选择视野中的所有细胞，同时记录阳性细胞百分数（阳性细胞百分数＝阳性细胞数／计算的羊膜上皮细胞数），然后计分（P）：①0分：小于5％的胎膜滋养细胞呈阳性；②1分：5％～10％的胎膜滋养细胞呈阳性；③2分：11％～50％的胎膜滋养细胞呈阳性，计；④3分：大于50％的胎膜滋养细胞呈阳性。同时对多数阳性细胞呈现的棕黄色计分（I）：①3分：强着色；②2分：中等着色；③1分：浅着色。最终的结果为组织学积分（H）＝P＋I。

1.4 统计学处理

采用SPSS 17.0医学统计软件对数据进行统计学分析。结果以±s表示，组间比较采用t检验，采用Spearman分析AQP9与Caspase3的相关性，检验水准为α＝0.05。

2 结果

2.1 AQP9及Caspase3在胎膜组织中的表达定位

AQP－9蛋白和Caspase3蛋白在实验组与对照组产妇的胎膜中均有阳性表达（结果见图1－4）。AQP－9蛋白和Caspase3蛋白主要表达于羊膜上皮细胞和绒毛膜滋养细胞，阳性信号主要定位于胎膜细胞的胞质中，AQP－9蛋白呈强阳性表达。

图1 羊水过少患者胎膜中Caspase3的表达

图2 正常产妇胎膜中Caspase3的表达

图3 羊水过少患者胎膜中AQP9的表达

图4 正常产妇胎膜中AQP9的表达

2.2 AQP9、Caspase3在胎膜组织中的表达比较

羊水过少组胎膜滋养细胞中Caspase3表达水平高于对照组，AQP9表达水平低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 胎膜细胞Caspase3、AQP8表达的组织学积分

2.3 AQP9、Caspase3在胎膜组织中的表达关系

羊水过少组胎膜滋养细胞中AQP9与Caspase3的表达并无相关性关系，而在羊水过少组胎膜滋养细胞中AQP9与Caspase3的表达水平呈负相关（r＝－0.72，P＜0.05）。

3 讨论

水通道蛋白（AQP）是一种膜整合蛋白，研究发现它是一类可介导水分子快速被动跨膜转运的糖蛋白，可以通过中间的小孔介导大量水分子及其他小分子物质跨膜转运，从而增加细胞膜对水分子的通透性。它是水分子跨生物膜转运的主要分子基础，保持人体细胞内外环境的稳态，同时也参与机体部分重要的生理功能。AQP除转运水分子外，还可以转运嘌呤、嘧啶、多元醇等小分子物质，因此推测AQP9参与了水和其它溶质由母体向胎儿的转运过程，决定羊水的膜内吸收途径［4－5］。最近几年有学者还发现在一些肿瘤细胞如肺癌、白血病细胞等也存在水通道蛋白9［6－8］，缺氧诱导因子的表达增加会使AQP的表达上调［9］。自Afire等在1988年发现水通道蛋白（AQP）后，目前在孕妇胎盘或胎膜上仅发现有AQP1、AQP3、AQP8和AQP9的表达［10］。AQP9除转运水分子外还被发现可以转运嘌呤、嘧啶、多元醇等小分子物质，因此推测AQP9参与了水和其它溶质由母体向胎儿的转运过程。国外学者在研究人类足月妊娠孕妇的胎盘胎膜时发现AQP9在羊膜上皮细胞、绒毛膜上皮细胞、胎盘合体滋养细胞及绒毛外层滋养细胞上均有表达。

ZhuX［11－12］等在研究原发性羊水过多的病因时，发现羊膜上皮细胞、绒毛膜滋养细胞中的AQP9的表达较正常组有明显的升高，但是在胎盘滋养细胞上AQP9的表达却是下降的，因此他们认为羊水过多发生时，机体启动代偿保护机制，通过增加胎膜上AQP9的表达以达到增加羊水的膜内吸收、减少羊膜腔内羊水量的目的，同时胎盘滋养细胞的AQP9的表达下降，导致母儿循环中胎盘血流量减少，羊水的生成也减少，从而共同达到减少羊水量的目的。LiuH［13－14］等也运用RT－PCR检测了5例羊水过多胎膜组织中AQP1、3、8、9mRNA的表达，发现羊水过多组孕妇胎膜中发现有AQP9mRNA表达显著高于正常组孕妇胎膜，同时在羊水过多组孕妇的胎盘上发现AQP9的表达明显下降，但并没有检测比较胎盘上的表达差异。XiongZ［15］等研究了5例正常的和羊水过少孕妇的胎盘上AQP1、3、8、9mRNA的表达，结果显示羊水过少组的胎盘组织中仅有AQP8mRNA表达显著低于正常组孕妇。在之后的研究中，LiP［16］等运用PCR技术发现羊水过少组羊膜上的AQP9mRNA表达含量明显少于羊水量正常组，并且地塞米松可能具有上调羊膜上皮细胞AQP9mRNA表达的作用，这些与Mann等的研究结果不太一致。

Caspase属于半胱天冬蛋白酶家族中的一员，是已知的该家族成员中执行机体细胞凋亡的关键酶之一，从而参与机体内细胞凋亡的过程。Caspase3作为一种效应Caspase，是细胞凋亡途径中末端底物酶分解的关键蛋白酶，更重要的是，它是细胞凋亡蛋白酶联反应的必经之路。作为凋亡的关键酶和执行者，它的表达就意味着细胞的死亡。Caspase3在正常妊娠胎膜绒毛滋养细胞的正常表达，确保正常胎膜细胞的凋亡，维持着母胎之间的物质交换及胎儿的正常发育。正常孕妇的胎膜细胞在胎膜发育全过程中进行有序的细胞凋亡。Simth［17］等发现胎膜中50％的凋亡细胞为滋养细胞，滋养细胞凋亡后细胞体积缩小，从而导致滋养细胞表面的水通道蛋白失活，不再介导水分子的跨膜运动，细胞对羊水的通透性下降，从而导致妊娠羊水过少的发生。

本研究通过运用免疫组化的方法发现光镜下AQP9蛋白和Caspase3在两组产妇的胎膜细胞的细胞膜和细胞质中均有表达，在阳性细胞的细胞膜和细胞浆中均可见明显的棕黄色染色阳性颗粒。相对于正常妊娠组，羊水过少组胎膜滋养细胞中AQP9蛋白的表达明显降低；Caspase3的表达以中度及强阳性为主，明显升高，差异均有显著性（P＜0.05）。由此推测，在羊水过少组的孕妇胎膜细胞上Caspase3的表达增加可诱导滋养细胞自身凋亡增加，干扰胎膜的结构甚至功能，从而使得及引起胎膜上血管网形成不良，导致物质交换障碍，影响体内的水代谢及其循环，从而降低母体、胎儿及胎膜之间的羊水等物质交换，引发羊水过少。AQP9蛋白表达下降后，一方面使得母胎液体交换、胎儿血容量及胎儿水分排泄均减少，从而减少胎儿尿液生成，导致羊水量的生成途径减少。另外Caspase3的表达增加可影响胎膜上水通道蛋白的结构和功能，使得AQP9的表达下降，会改变细胞对羊水的通透性，在一定程度上减少羊水膜内途径的重吸收，阻止过多的液体重吸收进入胎儿血循环，从而达到平衡羊水量的目的；最后，AQP9和Caspase3在胎膜组织中的表达异常可能也是引起胎膜老化的病理分子机制之一。

羊水过少的病因及发病机制至今尚未明确，它们在人母胎体液平衡及胎盘、胎膜羊水量的调节平衡中的确切机制有待于进一步研究，下一步我们期望通过扩大样本量，进行多因素分析和研究，从而寻找羊水过少发生的生物学特性，进一步揭示其发生、发展的规律，最终为羊水过少的早预防、早诊断和早治疗提供新的研究靶点和方法。

［1］候丽蓉，李世恭，王丽红.羊水过少132例临床分析［J］.山西医药杂志，2009，38（5）：437－438.

［2］秦海燕.78例羊水过少临床分析［J］.中国医药创新，2009，6（10）：37.

［3］Li u H，Zheng Z，Wintour EM.Aquaporins and fetal fluid balance［J］.Placenta，2008，29（10）：840－847.

［4］Feng XC，Ma TH.Water channel activity of plasmamembrane affects chondrocyte migration and adhesion［J］.Clin Exp Pharmacol Physiol，2008，35（1）：7－10.

［5］Papadopoulos M C，Saadoun S，Verkman A S，Aquaporins and cellmigration［J］.Pflugers Arch，2008，456（4）：693－700.

［6］Tan G，Sun SQ，Yuan DL.Expression of the water channel protein aquapor in－9human astrocytic tumours：correlation with pathological grade［J］.The Journal of International Medical Research，2008，36（4）：777－782.

［7］Arrighi S，Aralla M，Genovese P，et al.Undernutrition during foetal to prepubertal life affects aquaporin 9 butnotaquaporins 1 and 2 expression in themale genital tract of adult rats［J］.The riogenology，2010，74（9）：1661－1669.

［8］Shinkai Y，Sumi D，Toyama T，et al.Role of aquaporin 9 in cellular accum－ulation of arsenic and its cytotoxicity in primary mouse hepatocytes［J］.Toxicology and Applied Pharmacology，2009，237（2）：232－236

［9］Ding JY，Kreipke CW，Speirs SL，et al.Hypoxia－inducible factor lasignaling in aquaporin upregulation after traumaticbrain injury［J］.Neuroscience Letters，2009，（453）：68－72.

［10］刘慧姝，宋小飞，郝荣增.水通道蛋白1在人胎盘和胎膜的表达［J］.南方医科大学学报，2008，28（3）：333－336.

［11］Zhu X，Jiang S，Zou S，et al.Expression of aquaporin 3 and aquaporin 9 in placenta and fetalmembrane with idiopathic polyhydramnios［J］.Chin JObstetGynecol，2009，44（12）：920－924.

［12］Zhu X，Jiang S，Hu Y，Zheng X，et al.The expression of aquaporin 8 and aquaporin 9 in fetalmembranes and placenta in term pregnancies complicated by idiopathic polyhydramnios［J］.Early Hum，2010，86（10）：657－720.

［13］Liu H，Xiong Z，Hao R.Expressions ofaquaporin－1，3，8，9mRNA in human amnioticmembranes in polyhydramnious［J］.Chin JPerinatMed，2009，12（3）：199－200.

［14］Beall MH，Wang S，Yang B，etal.Placental and membrane aquaporin waterchannels：correlation with amniotic fluid volumeand composition［J］.Placenta，2007，28（5／6）：421.

［15］Xiong Z，Liu H，Hao R.Expressions of aquaporin 3－8 and 9 mRNA in human oligohydramnios placenta［J］.Chin J Biomed Eng，2010，16（2）：155－158.

［16］Li P，Hu Q.Effects of dexamethasone on aquaporin 9 expression in human amniotic epithelial cells of oligohydramnios［J］.Acta Academiiae Medicinae Zunyi，2012，35（6）：495－499.

［17］鞠晓静，朱振龙，魏守礼.水通道蛋白对凋亡的影响［J］.河北医科大学学报，2008，29（1）：118－120.

The expression of AQP9 and Caspase3 in membranes and their relatio ship w ith oligohydramnios

XIE Yan-fei，LIYing，LIHong-mei
（Department of Gynecology and Obstetrics，Yan＇an University Affiliated Hospital，Yan＇an 716000，China）

Objective To explore the event and the relationship between the expressions of AQP9 and Caspase3 in membranes of oligohydramnios and normal group.Methods Immunohistochemistry was performed to determine the expressions of AQP9 and Caspase3 in membranes from a test group（30 cases of oligohydramnios）and a control group（30 cases ofnormal pregnancy）.Results Immunohistochemistry showed the expression of AQP9 was lower in the test group than in the control，and the exp－ression of caspase3 inmembranesl trophoblastswas higher in the test group.The expression of caspase3 was inversely correlate－d with that of AQP9 in oligohydramnios（r＝－0．72，P＜0.05）.ConclusionThe expressio－ns of caspase3 and AQP9 in membranesmay play important roles in oli－gohydramnios.

oligohydramnios；membranes；AQP；caspase3；Immunohistochemistry

A

1672－2639（2014）01－0018－04

2014－01－20；责任编辑 赵菊梅］