邓莉莉，何 骁，彭艳辉

(1郴州市第一人民医院北院，湖南郴州423000;2郴州市第一人民医院中心医院; 3南华大学附属第一医院)

支气管哮喘是一种气道炎症性疾病，炎性细胞、细胞因子在哮喘发病中的作用是近年哮喘病研究的热点。2010年10月～2011年10月，我们对40例支气管哮喘患儿痰液嗜酸性粒细胞(Eos)比例、基质金属蛋白酶9(MMP-9)进行了测定，旨在探讨支气管哮喘患儿不同病程诱导痰液中上述指标的变化及临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择我院收治的轻度支气管哮喘患儿40例(观察组)，男20例，女20例;年龄6～10岁。均符合儿童支气管哮喘诊断标准［1］。排除标准:①除哮喘之外的喘息性疾病及其他呼吸系统相关性疾病(如支气管肺发育不良、支气管异物、胃食管返流等);②合并严重心肝肾等内脏疾病、免疫性疾病、血液系统疾病、传染性疾病、寄生虫疾病、皮肤病;③发病前2个月内曾经应用糖皮质激素及非糖皮质激素类抗炎药如色甘酸钠、白三烯调节剂、抗组胺抗过敏药物等;④不能耐受高渗盐水雾化或经高渗盐水雾化30 min后仍无痰的小儿或重度喘息发作者。另选同期健康体检儿童40例(对照组)，男21例，女19例;年龄5～9岁。两组一般资料无统计学差异。

1.2 痰液Eos计数及MMP-9检测方法

1.2.1 痰液诱导 参照欧洲呼吸协会诱导痰液指导小组的指南［2］并加以改进。对照组、观察组急性期(入院24 h内)及临床缓解期(临床症状停止及哮鸣音消失后5 d)进行诱导痰，具体方法如下:受试者清洁口鼻后吸入200μg沙丁胺醇，用医用面罩式超声雾化器，直接吸入 3%高渗盐水，流量为1 L/min，诱导20～30 min，诱导过程中随时将痰咳出，不易咳出者则由专职护师按正规操作吸痰，将痰置于干净、无菌的带刻度容器中。同时严密观察小儿的呼吸频率、气喘等情况，如不能耐受或吸入高渗盐水后30 min仍无痰液导出则立即停止操作。收集的痰液在1 h内处理，处理前4℃冰箱保存。

1.2.2 痰液处理 ①选取合格痰液。挑取含黏液的痰栓，显微镜下观察鳞状上皮细胞小于5%并可见肺巨噬细胞时认为是合格［3］。②将痰液称重，加入4倍痰量0.1%的二硫苏糖醇，在旋涡式混合器上混匀。③置于37℃恒温水育箱孵育15 min。④加4倍痰量磷酸盐缓冲液(PBS)后继续水浴5 min。⑤将稀化的痰液经48μm尼龙膜过滤后，离心机2 000 r/min离心10 min，收集上清液，-70℃冰箱保存待测;细胞成分重悬于PBS中，涂片2张，编号。

1.2.3 痰细胞染色 将涂片自然干燥后置于二甲苯内2 min。再移至无水乙醇内2 min，取出排液后移至90%乙醇内1 min。再移至苏木素染液内静置30 min，然后置入冲洗盆内冲洗10 min，使粉红色变为蓝色。涂片在盐酸乙醇内浸渍伴摇动数秒，再次冲洗使涂片再次变蓝。将涂片移到1%伊红液内2 min，对比染色，再冲洗涂片3 min，分化伊红。取出排液后移到90%乙醇内摇振15 s，再移至无水乙醇Ⅰ内摇振15 s，再移至无水乙醇Ⅱ内摇振30 s。涂片移至二甲苯Ⅰ内15 s，再移至二甲苯Ⅱ内15 s，取出后封固。

1.2.4 Eos计数 由不知道患者病情的病理医师在高倍显微镜下计数400个有核细胞(包括Eos、中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞)，计算Eos比例。

1.2.5 MMP-9检测 采用ELISA法检测两组痰上清液MMP-9。试剂盒由美国R＆D Systems公司提供，严格按说明书步骤操作。

1.3 统计学方法 采用SPSS15.0统计软件。所得数据以±s表示，两样本均数比较采用t检验，多个样本均数比较则采用方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，两变量之间相关性检验则采用直线相关分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

两组痰液中Eos比例、MMP-9水平比较，见表1。观察组急性发作期、临床缓解期MMP-9水平与Eos比例均呈正相关(r分别为0.89、0.92，P均＜0.01)。

表1 两组痰液中Eos比例、MMP-9水平比较(±s)

表1 两组痰液中Eos比例、MMP-9水平比较(±s)

注:与对照组比较，*P＜0.01;与同组临床缓解期比较，△P＜0.01

组别 Eos(%) MMP-9(ng/mL)观察组急性发作期 15.50±0.28＊△ 132.25±0.85＊△临床缓解期 10.78±0.25* 101.80±5.32*对照组0.48±0.54 41.04±0.45

3 讨论

支气管哮喘是气道炎症性疾病，急性炎症引起支气管平滑肌收缩、血浆渗出等，从而导致喘息急性发作。支气管哮喘也是慢性气道炎症，即在无症状的稳定期气道炎症仍存在，以致喘息反复发作和气道重塑。反复炎症刺激可引起气道重塑，其表现为气道壁增厚、气道平滑肌增生肥大及气道壁细胞外基质(ECM)各成分的改变。诱导痰是以高渗盐水雾化吸入诱导无痰或少痰受检者产生足量痰液，以对下气道分泌物中的细胞及其他液相成分进行分析研究的一种无创的检测方法。作为一种直接的非侵入性定量定性检测气道炎症的方法［4］，诱导痰安全、可靠［5］、简便且患者易于接受，其具体优点表现如下:①标本来源丰富，易浓缩和重复，且安全性高;②可提供与支气管肺泡灌洗液相似的气道炎症的定量信息;③可直接检出与炎症反应相关的炎性细胞、炎性介质和细胞因子;④诱导痰液来源于外周气道至中央气道比来源于肺段气道和肺泡的分泌物，更能反映气道分泌物的自然状态。

痰液细胞成分可进行细胞分类、免疫组化和分子生物学等检查，而液相成分可用于分子成分的测定，因此可对哮喘患儿的痰液细胞成分进行分析，以研究气道炎症发生的可能机制。Gereng等［6］发现，哮喘患者诱导痰中Eos的形态和功能与血液检测结果一致，Eos是临床上反映气道炎症的重要标志。本研究显示，观察组急性发作期Eos比例明显高于临床缓解期及对照组，说明Eos参与哮喘的发病，这与Louis等［7］研究结果一致;本研究还发现，观察组临床缓解期Eos比例亦高于对照组，提示喘息停止后气道炎症和气道高反应仍可以长期存在。因此，本研究为哮喘病长期规范治疗的必要性提供了一定的理论基础，即哮喘病诊断一旦成立，不论轻重，都需要进行及时且持续地抗炎治疗。

基质金属蛋白酶家族是由20多种高度保守的锌、钙离子依赖性蛋白内切酶所组成，可降解细胞外基质的大多数蛋白。在MMPs中，MMP-9与哮喘的关系最密切［8，9］。MMP-9的增加，可导致气道损伤，促进炎性细胞到达间质和气道壁，刺激、激活基质的生长因子，促进血管生成、成纤维细胞增生和分解呼吸道和肺内的结构复合物ECM和基底膜，因此参与呼吸道和肺的重建［10，11］。本研究显示，观察组急性发作期MMP-9水平明显高于临床缓解期及对照组，可知MMP-9水平升高是反映喘息急性发作及气道炎症变化较为客观的指标，此与Belleguic等［12］研究一致;本研究还发现，观察组临床缓解期MMP-9水平亦高于对照组，说明MMP-9作为气道炎症标志物，与喘息发作频率和发作的时间长短有关。同时亦提示不管是喘息正在发作，还是喘息停止，气道炎症依然持续存在。

在炎症状态下，炎性细胞和结构细胞表达MMP-9明显增强［13］。MMP-9降解时，其在内皮和上皮细胞基底膜上打孔，从而促使炎性细胞游出和聚集于靶器官。降解的片断具有趋化作用，可促进炎症反应的加重;气道的炎症可以引起气道的损伤，进而引起气道的修复和重塑。本结果显示，观察组急性发作期、临床缓解期MMP-9水平与Eos比例均呈正相关，说明两者共同参与了喘息发作的病理生理过程。ECM重建是哮喘发病的重要特征，在TNF-α刺激下，其主要效应细胞Eos的MMP-9转录水平显著增高。该现象可被NF-κB抑制剂和蛋白激酶C抑制因子所抑制，说明Eos受到炎性介质刺激后可大量合成MMP-9，参与气道的改建。同时活化的MMP-9又促进Eos穿越基底膜向炎性反应部位浸润，从而形成恶性循环。但MMP-9水平与Eos比例不是完全相关，这一点也提示气道炎症的改变并非仅由气道局部浸润的Eos决定，也许还存在其他因素的参与，具体机制尚需进一步研究。

总之，诱导痰炎性细胞尤其是Eos及细胞因子MMP-9与哮喘患儿气道病变的关系密切，两者能较好反映哮喘气道炎症状况，其有望成为无创观察哮喘病情变化的新指标。

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