赵安未，侯学东，富公弼

(沈阳医学院附属奉天医院，沈阳110024)

顺铂是治疗头颈部及泌尿生殖系统恶性肿瘤的化疗药物，除了可以直接杀伤肿瘤细胞外，还可诱导肿瘤细胞进入凋亡程序［1］。但是，顺铂与耳蜗组织结合后可激发产生大量的自由基，诸如超氧化物、过氧化氢、毒性脂质过氧化物等，这些氧自由基的增加可引起耳蜗毛细胞内的钙离子浓度增高并因此而导致毛细胞凋亡［2］;同时，顺铂还可明显降低耳蜗组织中抗氧化酶类的活性，产生内耳毒性［3］。连翘酯苷是连翘属植物中的咖啡酰糖苷类中主要有效成分之一，其具有显著的抗氧化、抗微生物感染和清除自由基、减轻过氧化损伤的作用。然而，连翘酯苷是否对顺铂的耳毒性起防护作用，尚未见报道。本研究观察了连翘酯苷对豚鼠顺铂耳毒性损伤的防护作用，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器 注射用顺铂(10 mg/支，齐鲁制药厂)，连翘酯苷冻干粉(天津一方科技有限公司)，兔抗蛋白激酶B(p-Akt)多克隆抗体(Santa-Cruz公司)，生物素标记羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)，二乙基焦碳酸盐(Sigma公司)，TRIzol试剂(北京鼎国生物公司)，Oligod T引物(由北京奥科生物技术公司合成)，LB563BEA型耳声发射分析测试系统(IHC公司)。

1.2 动物分组及处理 选用30只健康豚鼠，体质量250～300 g，雌雄不限，所有动物耳廓反射灵敏。由中国医科大学实验动物中心提供。随机分为对照组、顺铂组和连翘酯苷组各10只。动物自由食水，自然光照周期，稳定1周后用于实验。顺铂组及连翘酯苷豚鼠每天腹腔注射顺铂8 mg/kg，连续7 d;连翘酯苷组在每天腹腔注射顺铂溶液30 min前，腹腔注射连翘酯苷25.0 mg/(kg·d)，连续7 d;正常组以生理盐水代替顺铂溶液注射，连续7 d。实验期间所有动物均在安静状态下饲养并给予常规饮食。

1.3 畸变产物耳声发射(DPOAE)幅值检测 在隔音室内，豚鼠以戊巴比妥腹腔注射麻醉(50 mg/kg)，采用LB563BEA型耳声发射分析测试系统(IHC公司，美国)对处于麻醉状态的豚鼠进行DPOAE检测。选择初始纯音f1与f2，f1/f2=1.22，强度差L1-L2=10 dB SPL，取DPOAE幅值超过本底噪音3 dB为DPOAE检出标准，测试频率f02=f1×f2为1、2、4、6、8 kHz处的幅值。

1.4 耳蜗组织p-Akt蛋白表达检测 ①免疫组化法:将豚鼠麻醉，先用生理盐水从左心室灌注，同时剪开右心房。当右心房流出清亮液体后，再用10%中性缓冲甲醛灌注固定。断头剥离耳蜗，甲醛固定过夜，用0.4 mol/L EDTA(pH值7.2)脱钙7 d。常规石蜡包埋，平行于蜗轴方向切片，按SP试剂盒说明书测定p-Akt表达，采用图像分析软件计算光密度值。②Western blot法:将豚鼠麻醉处死，剥离出双侧耳蜗，置于4℃预冷的PBS中。在解剖显微镜下剥离蜗壳，取出耳蜗组织(基底膜及血管纹)，剪碎，加入组织裂解液中，4℃下匀浆，离心取上清，Bradford法测定蛋白浓度，等量蛋白样品经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、转印、4℃封闭过夜，一抗p-Akt(1∶200)和β-actin(1∶400)室温孵育2 h，TTBS洗涤10 min，3次，二抗(1∶2 000)室温孵育2 h，TTBS洗涤10 min，3次，ECL显影并扫描测光密度值。

1.5 统计学方法 采用SPSS18.0统计软件。计量资料以±s表示，各组比较采用方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组豚鼠DPOAE幅值比较 结果见图1。由图1可知，与正常组比较，顺铂组测试频率2、4、6、8 kHz处DPOAE幅值降低(P＜0.01);与顺铂组比较，连翘酯苷组测试频率2、4、6、8 kHz处DPOAE幅值升高(P＜0.05)。

图1 3组豚鼠DPOAE幅值检测结果

2.2 3组豚鼠耳蜗组织p-Akt蛋白表达比较 ①免疫组化结果:见图2，由图2可知对照组豚鼠耳蜗底转螺旋神经节p-Akt阳性细胞数较多，染色程度非常强;顺铂组豚鼠耳蜗底转螺旋神经节p-Akt阳性细胞数相对较少，染色程度也较轻;连翘酯苷组耳蜗底转螺旋神经节p-Akt阳性染色程度明显增强。对照组、顺铂组、连翘酯苷组豚鼠耳蜗p-Akt阳性表达的光密度值分别为0.79±0.08、0.34±0.04、0.61± 0.06，对照组、连翘酯苷组与顺铂组比较 P均 ＜0.01。②Western blot结果:见图3，由图3可知对照组豚鼠耳蜗p-Akt蛋白表达条带清晰粗大，顺铂组豚鼠耳蜗p-Akt蛋白表达条带明显变浅变细，连翘酯苷组的蛋白条带介于两者之间。对照组、顺铂组、连翘酯苷组豚鼠耳蜗p-Akt蛋白表达的相对光密度值分别为0.71±0.07、0.24±0.02、0.39±0.04，对照组、连翘酯苷组与顺铂组比较，P＜0.05或0.01。

3 讨论

顺铂为铂的金属络合物，是临床上最常用的抗肿瘤药物之一，主要对泌尿生殖系的膀胱、睾丸、卵巢及头颈部恶性肿瘤有效。但是因为其严重的耳毒性和肾脏损害限制了其临床的应用范围和剂量。研究［4，5］发现，塞来昔布和顺铂通过诱导凋亡抑制肿瘤的增殖，并且两者之间有协同作用，塞来昔布能够通过抑制P13K/Akt途径增强顺铂的抗肿瘤作用。说明顺铂和P13K/Akt途径具有相关性，但是顺铂能否通过P13K/Akt途径参与耳毒性作用尚未见文献报道。顺铂与耳蜗组织结合后可激发产生大量的自由基，诸如超氧化物、过氧化氢、毒性脂质过氧化物等，这些氧自由基的增加可引起耳蜗毛细胞内的钙离子浓度增高并因此而导致毛细胞凋亡［6］。顺铂在增加细胞内自由基活动的同时，还可明显降低耳蜗组织中抗氧化酶类的活性［7］。Akt是丝氨酸—苏氨酸蛋白酶，与多种细胞的存活信号相关联，一旦被激活，Akt可通过Bad和Caspase-9等底物磷酸化行使抗凋亡效应，直接调节凋亡机制，或通过人端粒酶催化蛋白亚单位、叉头蛋白转录家族成员和IB激酶等间接抑制凋亡［8，9］。研究［10］表明，Akt能够通过磷酸化其下游的多种作用底物促进肿瘤细胞的生长、增殖;抑制细胞凋亡;提高细胞的缺氧耐受;促进血管生成;促进肿瘤细胞侵袭、转移;促进对化疗和放疗的抵抗。研究［11，12］发现，Akt/mTOR通路的激活可以阻止顺铂对卵巢癌细胞的凋亡作用，Akt还可以通过抑制p53的磷酸化和细胞核功能导致人卵巢癌细胞发生DDP耐药。但是，顺铂作用后豚鼠耳蜗p-Akt表达是否发生变化尚不清楚。

图2 3组豚鼠耳蜗p-Akt蛋白表达的免疫组化染色结果

图3 3组豚鼠耳蜗p-Akt蛋白表达的Western blot检测结果

连翘酯苷作为连翘属植物中的咖啡酰糖苷类中主要有效成分之一，有很强的抗菌活性，抗菌谱广，对多种革兰阳性菌、阴性菌均有抑制作用，而且还有较强的抗病毒和调节免疫分子的作用［13］。现代药理学研究表明，连翘酯苷有显著的抗氧化、抗微生物感染和清除自由基、减轻过氧化损伤的作用。然而，连翘酯苷能否通过调节p-Akt的表达，从而对顺铂的耳毒性起防护作用，尚未见报道。本研究发现，顺铂组测试频率2、4、6、8 kHz处DPOAE幅值较正常组降低，提示顺铂的耳毒性损伤主要是高频的听力损伤;而连翘酯苷组测试频率2、4、6、8 kHz处DPOAE幅值较顺铂组升高，说明连翘酯苷对顺铂的耳毒性起到了一定的防护作用。本研究还发现，顺铂组豚鼠耳蜗p-Akt蛋白水平较正常组及连翘酯苷组降低，提示上调p-Akt的表达可能是连翘酯苷对顺铂的耳毒性防护作用的机制之一。

总之，连翘酯苷对豚鼠耳毒性损伤有防护作用，其机制可能与上调p-Akt表达有关。

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