曲孟，李秀辰，白晓磊，杨福利，孙彩玲

(大连海洋大学 辽宁省渔业装备工程技术研究中心，辽宁大连116023)

近年来，微藻作为一种重要的食品、化工和可再生能源的原料，备受人们关注［1-4］。但迄今为止，微藻的浓缩采收一直未能实现规模化生产，其原因是微藻细胞小、浓度低，采收成本过高［5-6］。目前，生产过程中常用的采收方法有离心分离法、过滤法、泡载分离法、絮凝沉淀法和气浮分离法等［7-8］，其中絮凝沉淀法具有操作简单、设备投资少等优点，常与其他方法一起配合使用［9-10］，但絮凝剂的选择很关键。张亚杰等［11］开展了聚合氯化铝(PAC)、聚合硅酸硫酸铝(PASS)和聚二甲基二烯丙基氯化铵(PDADMA)絮凝小球藻的研究，并对其实际应用的经济性进行了评价，得出最低浓缩成本约为589 元/t;Divakaran等［12］研究发现，壳聚糖对于小球藻具有较好的絮凝效果;张国权等［13］利用壳聚糖絮凝小球藻，降低了现行的采收成本，为生产食用级的微藻产品提供了依据;岳伟萍等［14］利用氢氧化钠对海链藻Thalassiosira nordenskioldi 进行絮凝试验发现，当氢氧化钠的质量浓度为0.05 g/L 时，细胞的采收率可达85%;吕乐等［15］发现，纳米铁具有高效沉降蓝藻的效果，当pH 为5 时，10 min 内可以絮凝沉降89.6%以上的水华蓝藻Cyan bacteria 细胞。

氢氧化钙是一种廉价易得的絮凝剂，电离产生游离Ca2+及各种带正电荷的水解产物，小球藻表面的多羟基有机酸或糖类发生离解，从而使藻细胞表面带有一定量的负电荷，两者通过吸附或者电中和聚团沉降［16-18］，而加入的氢氧化钙可以在培养微藻过程中用CO2去除，因此，氢氧化钙絮凝微藻具有一定的优势。但由于氢氧化钙的水溶性较低，且容易受藻液体系的pH、盐度等因素的影响，过多的添加量不仅达不到微藻采收的要求，且容易造成水体污染和成本浪费。薛蓉等［19］对比了硫酸铁、硫酸铝、三氯化铁和氢氧化钙对小球藻的絮凝效果，发现用氢氧化钙作为絮凝剂，成本最低，且上层清液可以继续用于培养小球藻，但是并未对絮凝条件进行优化。本研究中，选用氢氧化钙作为絮凝剂，在单因素试验的基础上，利用响应面分析法［20］对小球藻的絮凝条件进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料

小球藻Chlorella vulgaris 购自大连汇新钛设备开发有限公司，氢氧化钙(分析纯)购自天津博迪化工股份有限公司。

试验用仪器主要有 BSA124S 型电子天平、UV-7504 紫外可见分光光度计、雷磁pH-2F型pH 计、CX41 型生物显微镜。

1.2 方法

试验用小球藻原藻液的pH 为8.24，细胞密度为8.03×107个/mL，在680 nm 波长下的吸光度值(OD680nm)为0.921。

1.2.1 测定方法

(1)小球藻的细胞浓度。测定藻液在680 nm波长下吸光度值，用以间接表示小球藻生物量的变化，记为OD680nm［21］。

(2)小球藻的采收率。取100 mL 藻液，加入不同量的氢氧化钙，利用磁力搅拌器搅拌3 min，待均匀后静置，用注射器缓慢抽取液面下4 cm 处的藻液，测定OD680nm，根据下式计算微藻的采收率:

其中:OD0为初始时刻藻液的OD680nm;ODt为絮凝时间t 时藻液的OD680nm。

1.2.2 单因素试验设计

(1)絮凝时间对采收率的影响试验。取100 mL 藻液，按0.1、0.3、0.8、1.6 g/L 加入氢氧化钙，利用HJ-3 型恒温磁力搅拌器搅拌3 min 后絮凝，每隔20 min 用注射器分别缓慢抽取各组液面下4 cm 处的藻液，测定OD680nm，每次取3 个平行样求平均值，并计算采收率。

(2)絮凝剂添加量对采收率的影响试验。取100 mL 藻液，按0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6、1.8、2.0 g/L 加入氢氧化钙，固定絮凝时间，测定OD680nm，每次取3 个平行样求平均值，并计算采收率。

(3)藻液浓度对采收率的影响试验。取100 mL 原藻液，用蒸馏水分别稀释为原来的2、4、6、8、10 倍，固定絮凝时间和氢氧化钙添加量，测定OD680nm，每次取3 个平行样求平均值，并计算采收率。

(4)藻液pH 对采收率的影响试验。利用1 mol/L 盐酸和1 mol/L NaOH 调节藻液pH 为8 ～12，加入固定量的氢氧化钙，絮凝一定时间，观察不同藻液pH 对絮凝效果的影响。

1.2.3 响应面法优化试验设计 以单因素试验为基础，根据Box-Benhnken 中心组合试验设计原理，选取对小球藻采收率影响显著的因素，以3次平行试验所得的小球藻采收率的平均值作为响应值(Y)，通过Design Expert 8.0.5 软件进行响应面分析，在此基础上得出各因素之间的最佳组合。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 絮凝时间对絮凝效果的影响 从图1可见:絮凝剂添加量为0.3、0.8、1.6 g/L 时，小球藻的采收率随絮凝时间的增加而增大，前60 min 增加趋势明显，60 min 时采收率分别达到29.8%、80.5%和85.3%，之后，絮凝趋于稳定;当絮凝剂添加量为0.1 g/L 时，絮凝效果不明显，采收率小于3.5%。絮凝时间相同时，采收率随着絮凝剂添加量的增加而增大，絮凝时间为80 min 时，4 个絮凝剂添加量下小球藻的采收率分别为3.2%、30.3%、84.3%、89.4%。一般来说，絮凝时间越长，絮凝剂与藻细胞之间、藻细胞相互之间接触越充分，结团沉降就越完全，采收率也越高。薛蓉等［19］研究发现，利用氢氧化钙絮凝小球藻90 min时，采收率在90%左右，但是如果絮凝时间过长，生产周期延长，细胞的活性也可能会发生改变。因此，考虑生产周期成本以及藻体的质量，在本试验条件下，絮凝时间为60 ～80 min 时，絮凝效果较好。

2.1.2 絮凝剂添加量对絮凝效果的影响 从图1可见:随着絮凝剂添加量的增加，小球藻采收率随之增高;当絮凝剂添加量为0.6 g/L 时，小球藻絮凝效果骤增，采收率达到80.7%;絮凝剂添加量再增加时，采收率增加缓慢，当絮凝剂添加量从0.6 g/L 增加到1.4 g/L，采收率仅从80.7%增加到92.2%。这是由于絮凝剂添加量增加，藻体与絮凝剂之间的碰撞几率增大，絮凝效果显著，特别是当絮凝剂添加量增加到使藻液体系正负电荷中和的时候，絮凝效果最好，可获得较高的采收率。继续增加絮凝剂添加量，其对絮凝效果的影响减弱。因此，考虑到成本问题及后续生产的要求，在本试验条件下，絮凝剂添加量为0.6 ～0.8 g/L 时，絮凝效果较好。

2.1.3 小球藻浓度对采收率的影响 从图1可见:随着藻液浓度的降低，采收率随之降低;当稀释倍数为8 倍时，采收率达84.5%，但当稀释倍数从8倍增加到10 倍时，采收率从84.5% 急剧降到58.9%。可见，对于低浓度藻液，絮凝剂与藻细胞、藻细胞之间碰撞结团的几率相对减少，采收率随之降低。继续稀释时，体系中藻细胞数量较少，所带的负电荷不足以中和絮凝剂电离产生的阳离子所带的正电荷，从而产生一定的排斥作用，致使采收率下降较明显。因此，在本试验条件下，稀释倍数为2 ～8 倍时，絮凝效果较好。

图1 絮凝时间、絮凝剂添加量、小球藻浓度对采收率的影响Fig.1 Effects of flocculation time，flocculant dosage，and Chlorella vulgaris concentration on recovery ratio

2.1.4 藻液pH 对絮凝效果的影响 从表1可见:随着藻液pH 的增加，小球藻采收率下降，当藻液pH 由8 升至10 时，采收率由95.7%降至85.3%。这是由于随着pH 的增加，氢氧化钙的溶解性降低，电离产生的阳离子数量减少的缘故。倘若降低藻液pH，虽然有利于小球藻的采收，但对于其细胞的正常生长可能会产生影响，既不利于小球藻的循环培养，又会造成水体污染，从而增加了处理成本。当藻液pH 为11 ～12 时，产生的絮凝物过于分散，达不到采收要求，且沉淀的小球藻颜色部分发白，这可能是由于过高的碱性使得藻细胞大量失水而失去活性。因此，在本试验条件下，小球藻藻液的pH 为8 ～10 时，絮凝效果较好。

2.2 响应面法优化絮凝条件

絮凝时间、絮凝剂添加量和藻液pH 试验3 个因素的水平见表2，试验设计及试验结果见表3。

表2 响应面试验因素水平表Tab.2 Factors and levels in a response surface analysis(RSA)test

表3 响应面试验设计及试验结果Tab.3 Design and results of RSA test

运用Design Expert 8.0.5 软件对采收率试验结果进行回归分析，得到二次回归模型为

对模型(2)中各因素进行方差分析。从表4可见:絮凝时间、絮凝剂添加量和藻液pH 对采收率均有极显著性影响(P＜0.01)，其中絮凝剂添加量的影响最显著，其次是絮凝时间和藻液pH;絮凝时间与藻液pH 的交互作用以及絮凝剂添加量与藻液pH 的交互作用对采收率均有极显著性影响(P＜0.01)，且前者要大于后者，而絮凝时间与絮凝剂添加量的交互作用对采收率的影响不显著(P＞0.05);回归方程也具有极显著性(P＜0.01)，即絮凝时间、絮凝剂添加量和藻液pH 对采收率影响均极显著。

表4 采收率回归方程的方差分析Tab.4 ANOVA analysis of recovery ratio regression

响应曲面和等高线如图2 ～图4所示。从图2可见，曲面中的最高点在絮凝时间和絮凝剂添加量均达到最大时得到，和单因素试验结果一致，说明絮凝时间和絮凝剂添加量的交互作用对采收率的影响较低。从图2 ～图4可见:絮凝时间与藻液pH的交互作用对采收率的影响最显著;絮凝剂添加量对采收率的显著性影响要高于絮凝时间，絮凝时间和絮凝剂添加量对采收率的显著性影响均高于藻液pH，3 个因素对采收率的显著性影响依次为絮凝剂添加量＞絮凝时间＞藻液pH。响应面法分析结果与方差分析结果一致。

图2 Y=f(A，B)的响应面Fig.2 Responsive surface plot Y=f(A，B)

图3 Y=f(A，C)的响应面Fig.3 Responsive surface plot Y=f(A，C)

图4 Y=f(B，C)的响应面Fig.4 Responsive surface plot Y=f(B，C)

综上所述，利用氢氧化钙絮凝采收小球藻时，3 个因素中絮凝剂添加量对小球藻采收率的影响最显著，因此，首先要控制絮凝剂的添加量;同时，考虑到3 个交互作用中絮凝时间与藻液pH 的交互作用对采收率的影响最显著，合理控制絮凝时间与藻液pH 的交互作用，均可提高小球藻的采收率。

3 结论

(1)单因素试验结果表明，当絮凝时间为60 ～80 min、氢氧化钙添加量为0.6 ～0.8 g/L和藻液的pH 为8 ～10 时，最有利于小球藻的采收。

(2)三因素三水平的响应面试验结果表明，各因素对小球藻采收率均有极显著性影响，依次为絮凝剂添加量＞絮凝时间＞藻液pH，絮凝时间与藻液pH 以及絮凝剂添加量与藻液pH 的交互作用对小球藻采收率均有极显著性影响。絮凝时间、絮凝剂添加量和藻液pH 对小球藻采收率的影响可用二次回归模型来描述。通过响应面法优化得出，当絮凝时间为77 min、絮凝剂添加量为0.7 g/L和藻液pH 为9.3 时，小球藻采收效果最好，采收率为93.9%。

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