杜幸洁，张峰，张慧晓，文永佳，萨仁托雅

(大连海洋大学 农业部北方海水增养殖重点实验室，辽宁大连116023)

氯霉素(Chloramphenicol，CAP)是一广谱抗生素，对革兰阳性、阴性细菌均有抑制作用，但对阴性细菌的作用较强。由于氯霉素价格低廉、抗菌效果佳、药性稳定，在生产实践中常被作为饲料添加剂，用于预防、治疗细菌性疾病。然而CAP 对人体具有严重的毒副作用，它能抑制人体骨髓造血机能，导致各类血细胞减少，尤其是白细胞，而且它还容易引起人体再生障碍性贫血等，因此，CAP的残留限量标准在欧盟、美国等有关法规中规定为“零容许量”。中国农业部规定CAP 及其盐、脂等在食品动物的所有可食组织中不得检出［1］。

分子印迹技术(molecular imprinting technology，MIT)，又称为分子烙印技术，对其理论基础的研究主要有Fischer［2］的酶与底物作用的“锁与钥匙模型”、Pauling［3］早期提出的抗体形成学说和Dickey［4］的“专一性吸附理论”。分子印迹技术是以待测物或其结构类似物为模板分子，模拟自然界所存在的分子识别原理(如酶与底物、抗体与抗原等特异性识别)，合成具有专一识别功能的分子印迹聚合物(molecular imprinting polymers，MIP)的一种技术［5］。分子印迹聚合物因其制备简单，能专一识别目标分子，而且具有稳定性高、能重复使用、抗恶劣环境能力强(如抗酸、抗碱、抗高温)等特点而被越来越广泛地应用于很多领域。目前，所报道的氯霉素分子印迹膜大多是以电极［6-7］、滤膜［8］为支撑体合成的，主要被用于生物传感器［6-7］等，而以96 孔板为支撑体合成氯霉素分子印迹膜被用作人工抗体的研究尚未见报道。

本研究中采用本体聚合法，以氯霉素为模板分子，四氢呋喃为致孔剂，偶氮二异丁腈为引发剂，采用紫外灯引发聚合，在96 孔板上合成氯霉素分子印迹聚合膜，并且通过试验优化了该分子印迹膜的制备方法，为下一步用该膜代替氯霉素的生物抗体，采用直接竞争原理，合成酶标氯霉素，应用化学发光免疫法［9-10］检测氯霉素奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试剂:氯霉素(CAP，98%)、甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯(DEAEM，99%)、四氢呋喃(THF，99%)、偶氮二异丁腈(AIBN，99%)、甲砜霉素(TAP，99.5%)、氟甲砜霉素(FF，98%)、甲基丙烯酸(MAA，99%)、4-乙烯基吡啶(4-VP，99%)均购自阿拉丁试剂公司;乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA，98%)购自Sigma公司;甲醇、乙酸均购自上海生工生物有限公司;甲醇、乙酸均为分析纯。

仪器:Q3200B-型超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)、ZW-A 微量振荡器(常州澳华仪器有限公司)、HGC-12A 氮吹仪(天津市恒奥科技发展有限公司)、100 W紫外灯(λ=365 nm，飞利浦进口光源有限公司)、高效液相色谱仪(HPLC，大连依利特分析仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 CAP 分子印迹聚合物的合成 称取80 mg CAP 放入25 mL 圆底烧瓶中，并向瓶中加入5 mL THF，超声处理5 min;待CAP 溶解后向其中加入200 μL DEAEM，超声处理20 min;再加入50 μL EGDMA和0.02 g AIBN，超声处理20 min;超声处理结束后，以每孔25 μL 将混合液滴加到96 孔板上，将板放入密封袋中，充入氮气15 min，密封;将袋置于100 W 紫外灯下照射6 h。聚合反应结束后，用100 mL 甲醇乙酸混合液(二者的体积比为3∶1)超声洗脱模板分子，每4 h 更换一次洗脱液，用HPLC 检测，直至洗脱液中检测不到模板分子为止。

非印迹聚合物(NIP)的合成除不加入模板分子CAP 外，其余步骤同上。

1.2.2 聚合物吸附性能的测定 配制一系列CAP甲醇溶液(10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120 mg/L)，将其分别以每孔200 μL 滴加到MIP和NIP 中，再将MIP和NIP 置于振荡器上振荡80 min，结束后用HPLC 检测各种溶液中CAP 的浓度。每孔吸附量的计算公式为

其中:CI、CF分别为吸附初始和吸附结束后CAP甲醇溶液的浓度;V 为加入溶液的体积。

1.2.3 聚合物的吸附动力学曲线及吸附特异性分别配制初始浓度为50 mg/L 的CAP 甲醇、TAP甲醇和FF 甲醇溶液，以每孔200 μL 分别滴加到MIP 96 孔板上，振荡不同时间(5、10、20、30、40、50、60、70、80、90 min)，用HPLC 检测各种溶液中CAP、TAP和FF 的浓度，拟合得到3种物质的动吸附力学曲线。

2 结果与讨论

2.1 CAP 96 孔板分子印迹聚合膜制备条件的优化

2.1.1 功能单体的选择 试验中模板分子CAP和交联剂EGDMA 的用量固定不变，选择MAA、4-VP和DEAEM 为功能单体，以合成聚合物的最终吸附性为指标，检验3种功能单体合成聚合物的优劣。结果表明，以DEAEM 为功能单体，合成的CAP 分子印迹膜的吸附速率最快，能在50 min 内达到吸附平衡，而以MAA和4-VP 为功能单体，合成的印迹膜则吸附慢且吸附量少(表1)。所以，本试验中选用DEAEM 为功能单体。

表1 不同功能单体对分子印迹聚合膜吸附性的影响Tab.1 Influence of the functional monomers on the adsorption on imprinted film

2.1.2 功能单体用量的选择 试验中模板分子CAP和交联剂EGDMA 的用量固定不变，按照CAP与功能单体DEAEM 的摩尔比为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4和1∶5，选用不同用量的DEAEM，制备一系列聚合物，洗脱后测定其吸附量。从表2可见:当CAP 与DEAEM 的摩尔比不超过1∶4 时，随着DEAEM 用量的增大，CAP 分子印迹聚合膜对CAP 的吸附量也随之增加，可能是随着功能单体用量的不断增加，形成的CAP 分子空穴越来越多，因此聚合膜的吸附量也不断增加;当DEAEM 的用量为1.00 mmol 时，聚合膜的吸附量达到最大(1.49 μg/孔);当CAP 与DEAEM 的摩尔比超过1∶4 时，聚合膜的吸附量反而减小，可能是因为功能单体过多时发生自体聚合，影响了CAP 分子空穴的形成，导致聚合膜的吸附量减少。所以，本试验中选用模板分子CAP 与功能单体DEAEM 的摩尔比为1∶4。

2.1.3 溶剂的选择 溶剂不仅给每个反应物质提供了一个良好的聚合反应环境，而且在聚合物形成过程中还充当着致孔剂的作用。常用于聚合反应的有机溶剂有THF、乙醇、乙腈等。本试验结果表明，利用乙醇和乙腈作为溶剂在96 孔板上合成的聚合物均不规则，可能是由于乙醇和乙腈挥发性太强，导致孔壁上都粘有聚合物，有时甚至都挥发到密封袋上，给后续的吸附试验和检测带来很多困难，而且交联剂用量少时，用乙醇作溶剂合成的聚合膜不能牢固地粘到板上，易脱落，形成的聚合膜易碎，洗脱时聚合膜易融化在甲醇乙酸混合洗脱液中。而用THF 作为溶剂，制备的CAP 聚合膜能牢固地粘在板上，无论如何洗脱都不会脱落，孔壁上也未粘有聚合物，洗脱后板可重复使用。所以，本试验中选用THF 作为溶剂，且溶剂的量为5 mL。

2.1.4 交联剂用量的选择 试验中模板分子CAP和功能单体DEAEM 的用量固定不变，按照CAP与交联剂EGDMA 的摩尔比为1∶0.5、1∶1、1∶2和1∶3，选用不同用量的EGDMA，制备出一系列聚合物，洗脱后测定其吸附量。从表3可见:当CAP 与EGDMA 的摩尔比为1∶1 时，聚合膜的吸附量最大(1.49 μg/孔);随着EGDMA 用量的增加，聚合膜的吸附量减少，可能是因为交联剂用量过多时，导致交联太过致密，影响了CAP 分子空穴的形成，同时也由于交联致密，导致洗脱困难，洗脱不完全，模板分子残留在其中，使吸附量降低。所以，本试验中选用模板分子CAP 与交联剂EGDMA的摩尔比为1∶1。

表2 功能单体DEAEM 用量对CAP 聚合膜吸附性的影响Tab.2 Influence of DEAEM amount on adsorption on the imprinted film

表3 交联剂EGDMA 用量对CAP 聚合膜吸附性的影响Tab.3 Influence of EGDMA amount on the adsorption on the imprinted film

2.1.5 引发剂用量的选择 将模板分子CAP、功能单体DEAEM和交联剂EGDMA 按照1∶4∶1 的摩尔比固定不变，采用不同用量的引发剂AIBN(0.005、0.010、0.020、0.030、0.040 g)制备出一系列CAP 分子印迹聚合膜。结果表明:当AIBN用量超过0.020 g 时，随着AIBN 用量的增多，聚合物在孔壁上的形状不规则，不具有膜的外观，而且膜的吸附量也并未增加;但当AIBN 用量过少时，虽然孔里形成的聚合物很整齐，具有膜的外观，但膜的吸附量明显降低。这可能是因为引发剂用量过少时，导致引发力度过低，聚合反应不充分，聚合膜的吸附量也随之减少。所以，本试验中选用0.020 g AIBN 来引发聚合反应。

2.1.6 聚合时间的选择 将聚合物在紫外灯下分别照射4、5、6、12、18、24 h，然后用甲醇乙酸混合液洗脱模板分子。结果表明:聚合时间越长，模板分子越难洗脱，不仅洗脱时间延长，而且模板分子渗漏严重;聚合时间过短时，聚合反应不完全，虽洗脱容易，但吸附量明显减少。所以，本试验中选用6 h 作为聚合时间。

2.2 CAP 分子印迹聚合膜的吸附性

从图1可见:随着CAP 初始浓度的增加，MIP和NIP 对CAP 的吸附量均增加，并且在每一初始浓度下，MIP 要比NIP 的吸附量多;当CAP 初始浓度为120 mg/L 时，MIP 对CAP 的吸附量可达1.51 μg/孔，而NIP 对CAP 的吸附量仅为0.85 μg/孔。

图1 CAP 分子印迹膜的吸附性Fig.1 Adsorption isotherms of the imprinted and nonimprinted film

2.3 CAP 分子印迹膜的吸附动力学曲线及吸附特异性

从CAP 分子印迹膜对CAP、TAP和FF 3种物质的吸附动力学曲线(图2)可见:印迹膜在20 min 内就完成了对CAP 56%的吸附量，在50 min时基本达到吸附平衡;而印迹膜对TAP和FF 也都能吸附，但对FF和TAP 的吸附量均比CAP 少;达到吸附平衡时，印迹膜对CAP 的吸附量为0.83 μg/孔，而对TAP和FF 的吸附量分别仅为0.49、0.40 μg/孔。说明CAP 分子印迹膜对CAP 的吸附具有特异性。

图2 CAP 分子印迹膜的吸附动力学曲线及吸附特异性Fig.2 Specificity of the chloramphenicol imprinted film

3 结论

本研究中，在96 孔板上制备了一种CAP 分子印迹膜，通过试验优化了制备条件并测定了该膜的吸附量及吸附特异性。

(1)当模板分子、功能单体DEAEM 与交联剂EGDMA 的摩尔比为1∶4∶1，模板分子物质的量为0.25 mmol，THF 溶剂的量为5 mL，在100 W 紫外灯下照射6 h 时，制备的CAP 分子印迹膜吸附效果最佳，可在50 min 内达到吸附平衡，当CAP 初始浓度为120 mg/L 时，吸附量可达1.51 μg/孔。

(2)吸附特异性试验结果表明，当CAP、TAP和FF 的初始浓度为50 mg/L，达到吸附平衡时，印迹膜对CAP 的吸附量为0.83 μg/孔，而对TAP和FF 的吸附量分别为0.49、0.40 μg/孔。说明该膜对CAP 具有专一识别能力。

(3)与生物抗体的难制备相比，此膜用作人工抗体具有生物抗体所不可替代的优势:制备成本低、稳定性高、抗恶劣环境能力强、能重复使用。

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