尹立平

(天津市宝坻区药品检验所，天津301800)

细菌内毒素检查法动态浊度法*

尹立平

(天津市宝坻区药品检验所，天津301800)

查阅有关文献资料，对细菌内毒素检查法－动态浊度法的原理、试剂要求、实验设计、试验方法、应用等方面做一归纳，总结了选用实验试剂注意问题、操作关键技巧、试验步骤、建立标准曲线和回收率计算方法及其在药品检验中的应用。

细菌内毒素检查法，动态浊度法，内毒素，鲎试剂

细菌内毒素检查法也称鲎试验法，用来判定供试品中内毒素含量的限量是否符合规定的分析方法。目前，国内外药典收载的有凝胶法、浊度法和显色法。2010年版《中国药典》二部附录中，将光度测定法中动态浊度法收载为测定内毒素含量的方法之一。

1 实验原理

动态浊度法是由内毒素与鲎试剂的C因子反应，被激活的凝固酶切断凝固原蛋白中的精氨酸肽链，形成凝固蛋白，在产生凝胶过程中发生浊度变化，用浊度仪检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。此方法灵敏度高，操作简单，检测范围广(0.006～300 EU/ml)。

2 试验试剂

2.1 内毒素标准品细菌内毒素标准品是保证试验的平行与重复性的重要参照标准物质，主要分为工作标准品CSE和国家标准品NS/RSE。日常检验时，一般均使用廉价的工作标准品。动态浊度定量法使用的内毒素标准品要求稳定性好，效价准确，具有很好的重现性。内毒素标准品的稀释过程操作是试验关键，不正确操作会导致效价偏低，灵敏度标示偏高、阳性对照不凝等［1］。故而2010年《中国药典》要求内毒素标准品溶解后，在旋涡混合器上混合15 min，以后每一步稀释前最少混合30 s［2］。

2.2 鲎试剂内毒素检查法结果准确度与所用鲎试剂的灵敏度关联极大［3］，细菌内毒素检查时不能使用灵敏度值高于限值的鲎试剂。动态浊度法应该选用定量法鲎试剂，要求最低检测限0.03～0.005 EU/ml。现在市售的美洲鲎试剂(缩写为LAL)与东方鲎试剂(缩写为TAL)，功效相同。国产定量专用TAL目前有KT、KTA系列。KTA最低检测限达到0.005 EU/ml，可满足于动态浊度法检测需要。

2.3 细菌内毒素检查用水试验中鲎试剂的溶解、细菌内毒素标准品及供试品的稀释都要用细菌内毒素检查用水，不可以普通检查用水代替。2010年版《中国药典》明确要求动态浊度测定法所用细菌内毒素检查用水内毒素含量小于0.005 EU/ml，且对内毒素试验无干扰作用。

3 实验设计

3.1 内毒素限值(L)的确定有两种方法可以确定内毒素限值(L)［4］:①依《中国药典》规定:《中国药典》2010年版中有规定检查细菌内毒素项的化学药424个，生物制品39个品种的正文可以查到相应的L值。②根据人的最大注射剂量:计算公式为L=K/M，L为供试品的细菌内毒素限值(以EU/ml、EU/mg、EU/U表示)。K为人用按规定的给药途径不发生任何临床不良反应时，每kg体重每h最大可接受的内毒素剂量，以EU/kg·h－1表示。静脉(包括im，ip，SC，ia): 5.0 EU/kg·h－1;放射性药品:2.5 EU/kg·h－1;鞘内: 0.2 EU/kg·h－1。M为人用每kg体重每h最大给药剂量，以ml/kg·h－1、mg/kg·h－1、U/kg·h－1等表示，中国成人人均体重按60 kg计算，人体表面积按1.62 m2计算，注射时间小于1 h的按1 h计算。

3.2 最大有效稀释倍数(MVD)药品细菌内毒素检查时，当内毒素限值L=A值(鲎试剂灵敏度)时，经干扰实验证实无干扰，可以直接检查。当L＞A值时，需要稀释供试品，但稀释的倍数不能超过最大有效稀释倍数，用MVD表示。其计算公式为MVD=LC/λ，C为供试品溶液浓度，L为供试品的内毒素限值，λ为动态浊度法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。当L以EU/mg、EU/U表示时，C的单位为mg/ml、U/ml;当L以EU/ml表示时，C为1.0 EU/ml;当供试品为注射用无菌粉末或原料药时，MVD=1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C=λ/L。

3.3 标准曲线的可靠性试验当试验条件发生了改变或使用新批号的鲎试剂时，都可能会影响检验结果，此时需制作标准曲线来确认试验的可靠性［5］。根据2010年版《中国药典》二部附录要求，制备细菌内毒素工作标准品稀释液，例如2倍稀释1.0、0.5、0.25、0.125和0.062 5 EU/ml，4倍稀释2.00、0.50、0.125、0.031 25 EU/ml。将3个浓度的稀释液，每一浓度的3支平行管的稀释液各取适量分别加入到预先加有0.1 ml鲎试剂的实验管中，混合均匀，插入细菌内毒素测定仪进行检测，同时做2支阴性对照。当阴性对照在规定的时间内不发生反应，将全部数据用最小2乘法进行线性回归分析。根据线性回归分析，标准曲线的相关系数r≥0.980，证明试验有效，否则须重新试验。

3.4 干扰试验鲎试验法中为了确认供试品的pH值、温度、浓度及蛋白质和一些非内毒素杂质等对内毒素的检测不产生干扰，无论新药老药在建立内毒素检查法时需先做干扰试验，当供试品的来源、配方、生产工艺改变或使用新批号鲎试剂等任何可能会影响检验结果时，都需重做干扰试验。

3.4.1 干扰预试验将供试品用细菌内毒素检查用水依次稀释至2倍、4倍、8倍、16倍……，最后的稀释倍数不得超过MVD，记为Ai液。一般不要以市售鲎试剂灵敏度计算所得的MVD作为起始浓度。注射液建议采用原液，粉针剂建议至少尝试往上几个浓度级，探索其干扰程度，如没有干扰，方法则更可靠。以相同稀释倍数的供试品溶液加入标准曲线中点(或附近点)浓度(设为λ1)的内毒素标准品，记为Bi液。分别取上述各液(每一浓度至少做3支平行管)适量加入预先加有0.1 ml TAL试剂的反应管内，混匀，立刻用细菌内毒素检测仪进行检测。实验数据回归处理，按所得线性回归方程计算平均回收率。回收率(%)=(Bi液内毒素值－Ai液内毒素值)/λ1×100%。当内毒素的回收率在50%～200%之间，则认为在该试验条件下供试品溶液不存在干扰作用。当内毒素的回收率不在指定的范围时，可用加热、过滤、中和、透析等方法去除干扰因素(注意不要使供试品内毒素失去活性)，重新进行干扰试验。

3.4.2 正式干扰试验一般选择干扰预试验中内毒素回收率接近100%的最大不干扰浓度或最小稀释倍数，即可用这一最大不干扰浓度进行预干扰试验的验证。取不同厂家不同批号最少3批样品制备下列供试液:①通过干扰预试验的供试品溶液，不加内毒素，稀释倍数不超过MVD;②加入标准曲线中点(或附近点)的一个已知内毒素浓度(设为λm)的供试品溶液，与①溶液稀释倍数相同;③制备标准曲线的标准内毒素溶液，至少3个浓度(最低一点设为λ);④细菌内毒素检查用水，不加内毒素，作为阴性对照。按干扰预试验方法检测，计算内毒素回收率，如果回收率在50%～200%之间，则确认在该试验条件下可进行该供试品内毒素检查。

3.5 供试品检查供试品为不同厂家不同批号最少3批，按干扰试验中的操作步骤进行检测。用溶液②中的内毒素浓度减去溶液①中的内毒素浓度，计算出的内毒素的回收率，要在50%～200%的范围内。溶液④(阴性对照)反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间。用溶液③生成的标准曲线来(溶液③的结果要符合r≥0.980的要求)计算溶液①的每一平行管的内毒素浓度，若供试品溶液平行试验所得平均内毒素浓度乘以稀释倍数后，小于规定的内毒素限值，则判定供试品符合规定;若大于或等于规定的内毒素限值，判定供试品不符合规定。

4 应用

《中国药典》2010年版要求内毒素检查的化学药品424个，生物制品39个，多采用鲎试剂凝胶法或凝胶半定量法，采用动态浊度法定量测定的较少。近几年仪器试剂的发展，技术的提高，有大量的文献报道采用动态浊度法测定细菌内毒素含量。

4.1 化学药化学药类应用动态浊度法测定内毒素含量报道较多，涉及到普通注射剂、抗菌药物、原料药和放射性药品等，如詹云丽等［6］研究利巴韦林输液中细菌内毒素含量，采用动态浊度法，结果表明将混合液稀释至5倍后进行细菌内毒素定量检测是可行的。劳海燕等［7］对8种注射用头孢菌素类抗生素定量稀释，回收率为50%～200%，证实动态浊度法可以高效的测定头孢类药物的内毒素含量。顾炳仁等［8］将精氨酸原料药配制成12.5 mg/ml的溶液时进行动态浊度定量测试效果满意。王海云［9］对4种放射性药品建立标准曲线，完成了动态浊度法测定内毒素含量。

4.2 中药中药注射剂成分复杂，干扰较多，苑庆华等［10］用细菌内毒素动态浊度法定量检测柴胡注射液的细菌内毒素含量，稀释到32倍时排除干扰，回收率在50%～200%范围内，方法可行。黄桂勇等［11］使用细菌内毒素的动态浊度法可以高效地测定复方当归注射液的细菌内毒素含量。舒玉萍等［12］在复方苦参注射液细菌内毒素定量检查法的实验探讨中，供试液稀释20倍无干扰，回收率50%～200%范围内，可应用动态浊度法定量测定其细菌内毒素含量。

4.3 生物制品马丽等［13］用动态浊度法对胸腺肽进行细菌内毒素含量测定，结果可行。罗宇芬等［14］对β－七叶皂苷钠通过动态浊度法进行干扰试验和验证试验，结果16倍稀释无干扰。宾漫容等［15］对脑组织注射液应用动态浊度法检测细菌内毒素，结果回收率在50%～200%，证明可用动态浊度法测定其内毒素含量。

内毒素动态浊度法由于标准曲线的建立，最大限度地消除了内毒素标准品对试验结果的影响，试验结果不受内毒素标准品准确性的影响，同时计算回收率更科学，对样品干扰行为的描述更为准确，结果可以保存，利于质控，有可追溯性，尤其对于中药注射剂，其定量意义更为重要。

1卫国，郑江.细菌内毒素定量检测的影响因素分析及对策［J］.局解手术学杂志，2003，12(3):214－215

2中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:287－302

3张红霞，陈慧，马金刚.影响鲎试剂灵敏度测定结果因素的分析［J］.中国药师，2007，10(8):825－826

4夏振民.药品细菌内毒素检查的限值［J］.药物分析杂，1995，15 (3):54

5黄清泉，夏振民.药品细菌内毒素检查的试验设计［J］.中国药学杂志，1997，32(2):72

6詹丽云，李楚云，刘杜妙，等.利巴韦林输液中细菌内毒素定量检测的研究［J］.药理与毒理，2010，21(7):47－48

7劳海燕，林秋晓，冯聚锦.注射用头孢菌素类抗生素细菌内毒素动态比浊定量法的研究［J］.中国药科大学学报，2005，36(3):234－237

8顾炳仁.动态浊度法测定精氨酸中细菌内毒素的含量［J］.中华实用医药杂志，2009，9(8):17－18

9王海云.高锝［99mTC］酸钠注射液等4种产品的细菌内毒素定量测定［A］.中国原子能科学研究院年报，2007:303

10苑庆华，芮菁，华晓东.柴胡注射液中细菌内毒素定量检查研究［J］.西北药学杂志，2002，17(6):260－262

11黄桂勇.复方当归注射液中细菌内毒素定量测定法［J］.山西中医，2008，24(2):53－54

12舒玉萍，王美云.复方苦参注射液细菌内毒素定量检查法的实验探讨［J］.齐鲁药事，2008，27(9):539－541

13马丽，宾漫容，陈焕勇，等.胸腺肽注射液中的细菌内毒素的定量检查［J］.中国生化杂志，2002，23(6):302－303

14罗宇芬，劳海燕，林秋晓，等.动态比浊法鲎试验用于注射用β－七叶皂苷钠细菌内毒素检测［J］.中国医院药学杂志，2002，22(1): 7－8

15宾漫容，马丽，陈焕勇，等.动态浊度法定量检测脑组织注射液中的细菌内毒素［J］.中国现代应用药学杂志，2002，19(6):493－494

R927.12

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1006-5687(2014)01-0050-03

2013-12-03