何丽娟 马桂云 郭金芝 刘文波 任晓明

（石家庄以岭药业股份有限公司,石家庄050035）

夏荔芪胶囊微生物限度检查方法研究

何丽娟 马桂云 郭金芝 刘文波 任晓明

（石家庄以岭药业股份有限公司,石家庄050035）

目的 为了消除夏荔芪胶囊在微生物限度检查中药用成分的抑菌作用,建立其适宜的微生物限度检查方法。方法 本试验采用平皿法和培养基稀释法对该品种进行微生物限度检查方法验证,通过三次独立平行试验,各试验菌的回收率均可达到70%以上。结论 采用平皿法、培养基稀释法联用检查细菌数,霉菌及酵母菌数,可客观地反映该药物中微生物的污染状况,且可操作性强。

夏荔芪胶囊;微生物限度检查;平皿法;培养基稀释法;回收率

夏荔芪胶囊是我公司自主研发的国家中药六类新药。新药“夏荔芪胶囊”针对良性前列腺增生的主要病证,以健脾益肾,利水散结为治疗原则,结合多年临床用药经验研制而成,为良性前列腺增生症患者提供了一种疗效确切、服用安全的中药新制剂,为更多患者解除病痛。夏荔芪胶囊处方中有多味中药材含有抑菌成分,抑制了药品中污染微生物的生长,这就给药品质量检验环节造成了安全隐患,因此为了准确而有效的保障药品质量,我们根据《中国药典》2010年版[1］的要求对夏荔芪胶囊进行了微生物限度检验方法验证,以期获得更具科学性和准确性的微生物限度检查方法,从而保证检验结果的准确性。

1 药物与试剂

1.1 样品 夏荔芪胶囊,规格：0.45g/粒;批号：110201-1,110201-2,110201-3;生产厂家：石家庄以岭药业股份有限公司。

1.2 培养基 营养琼脂培养基（批号：20120702）;改良马丁琼脂培养基（批号：121106）;玫瑰红钠琼脂培养基（批号：20111209）;营养肉汤培养基（批号：120610）;改良马丁培养基（批号：120417）;来源：中国药品生物制品检定所。

1.3 菌种 金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003］;枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501］;大肠埃希菌[CM-CC（B）44102］;白色念珠菌[CMCC（F）98001］;黑曲霉[CMCC（F）98003］,来源：中国药品生物制品检定所[2］。

1.4 仪器 生化培养箱：LRH-250F上海一恒仪器有限公司;生物安全柜：FHC-1200A美国Frontline。

2 菌液及供试品的制备

2.1 菌悬液的制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上,培养18～24h;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上,培养24～48h。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液。

接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上,培养5～7d,加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱。然后,采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内,用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液[2］。

2.2 供试品制备 称取样品10g,加p H7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml制成1∶10的供试液。

3 细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证

3.1 菌液组 取1ml上述制备的菌液,注入平皿中,立即倾倒琼脂培养基,每株试验菌平行制备3个平皿。结果见表1。

3.2 试验组

3.2.1 平皿法 取试验可能用的最低稀释级供试液1ml和50～100cfu试验菌,分别注入平皿中,立即倾注琼脂培养基,每株试验菌平行制备2个平皿,按平皿法测定其菌数。结果见表2。

3.2.2 培养基稀释法 取1∶10供试液2ml,每1ml供试液等量分注2个平皿,每4个平皿为一组。取上述制备好的阳性对照菌液1ml,分组注入平皿中,倾注琼脂培养基,混匀,凝固后,倒置培养。按平皿法测定其菌数,计算回收率,结果见表3。

4 结果与分析

表1 菌液组计数

由表1可知：五株试验菌适宜稀释度菌悬液菌落个数都在50～100cfu之间,因此符合微生物限度检查方法验证用菌种稀释度要求。

表2 微生物限度检查法(平皿法)污染菌回收率（%）

从表2可以看出：通过三次独立平行试验,计数结果显示[2］,只有金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的回收率在70%以下,而大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率均大于70%,因此可确定大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉可采用平皿法进行微生物限度检查,而金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌应进一步进行微生物限度检查方法验证。

表3 微生物限度检查法培养基稀释法(0.2ml/皿)回收率（%）

从表3可以看出：采用培养基稀释法（0.2ml/皿）金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的回收率已在70%以上,因此可确定金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌可以采用培养基稀释法（0.2ml/皿）进行微生物限度检查。

5 讨论

通过方法验证可知：细菌、霉菌及酵母菌限度检查可采用平皿法联合培养基稀释法（细菌0.2ml/皿,霉菌1ml/皿）进行检查。

中药制剂质量标准检查项目内容之一的微生物限度检查是保障药品使用安全的重要工作,日益受到重视[3］。本试验采用平皿法联合培养基稀释法,解决了夏荔芪胶囊中抑菌成分对微生物检验的干扰问题,该法操作简单,能科学、准确、有效地反映夏荔芪胶囊药品中污染存活的微生物菌落数。

[1］国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[S］.2010年版.北京：中国医药科技出版社,2010,附录XIJ,附录107-113.

[2］许华玉,杜芸,钱文静,等.药品微生物限度检查法中细菌和真菌计数方法的验证实验[J］.中国中药杂志,2005,30（24）：1918-1920.

[3］陶红.中药制剂微生物限度检查方法研究进展[J］.中国药房,2010,（19）：1813-1814.

Research on Microbial Limit Test for Xialiqi Capsule

He Lijuan Ma Guiyun Guo Jinzhi Liu Wenbo Ren Xiaoming
(Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co.,Ltd.,Shijiazhuang,Hebei Province,050035,China)

Objective To develop an appropriate protocol to remove the antimicrobial activity of Xialiqi Capsule and establish a suitable method for the microbial enumeration testing.Methods A combination of the plating procedure and media dilution method was used to do the validation.In the three independent parallel tests,the mean counts of each of the test organisms were all not less than 70%.Conclusion The combination of the plating procedure and media dilution method was verified to be an appropriate method for microbial enumeration testing.The validated method is easily operational,and can reflect the microbial contamination condition objectively.

Xialiqi Capsule;Microbial limit test;Plating procedure;Media dilution method;Recovery rate

10.3969/j.issn.1672-2779.2014.01.098

1672-2779（2014）-01-0154-02

��吴义红 本文校对：马 英

2013-11-11）