刘 涛，张 伟，刘 娟，张 磊，周清波

(1.佳木斯大学药学院生药学教研室，黑龙江 佳木斯 154007；2.第二军医大学药学院药用植物学教研室，上海 200433)

地龙是一味传统动物类中药，具有清热定惊，通络平喘，利尿等功效。根据《中国药典》2010年版的记载，环节动物门寡毛纲动物地龙分为参环毛蚓Pheretima aspergillum (E.Perrier)、通俗环毛蚓Pheretima vulgaris Chen、威廉环毛蚓Pheretima guillelmi (Michaelsen)或栉盲环毛蚓Pheretima pectinifera Michaelsen的干燥体。前一种习称“广地龙”，后三种习称“沪地龙”[1]。有研究发现，有溶栓、抗菌、抗肿瘤等作用，并广泛应用于临床[2]。此外，在水产养殖、农业、治理环境污染、食品等方面均具有重要的经济价值[3]。随着地龙及其相关产品的开发，其原动物及药材需求量正逐年快速增长。产自上海的沪地龙药用价值较高，是公认的道地药材，但目前市面上沪地龙药材来源比较复杂，优劣品种混杂，特别是经过加工或者炮制过的地龙药材，采用一般的传统地龙药材鉴别方法很难对其种源品质等方面进行正确的鉴别分析，严重影响了地龙药材的应用与开发。

简单重复序列间扩增(inter-simplesequence repeat,ISSR)是一种新型的分子标记技术，在PCR反应基础上建立反应体系，与以往的随机引物扩增多态DNA(random amplified pdymorphic DNA,RAPD)、简单重复序列(simplesequence repeat,SSR)标记技术相比，ISSR能够提供更多、更稳定可靠，重复性更好的基因组DNA信息[4]。目前在品种鉴定[5]、多样性分析[6，7]等方面均有广泛的应用研究。

现采用单因素设计试验对影响其鉴定结果的各影响因子进行分析筛选，从而建立最佳地龙ISSR-PCR体系，为深入研究地龙药材的遗传多样性提供了技术支持。

1 实验材料

实验所用的原材料为新鲜动物威廉环毛蚓Pheretima guillelmi(Michaelsen)，采自上海市第二军医大学药用植物园，取新鲜地龙10条，将其编号，液氮速冻后置于-70℃超低温冰箱备用，用于基因组DNA的提取及ISSR-PCR研究。基因组DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司(批号：DP304)；Premix Taq聚合酶(批号：R004A)与DL2000 DNA Marker(批号：3427B)均购自宝生物工程(大连)有限公司；ISSR引物序列来自University of British Columbia发布的100个序列[8]，由上海生工生物工程有限公司合成；50×TAE缓冲液由上海生工生物工程有限公司生产。

2 实验方法

2.1 DNA的提取与检测

将置于-70℃超低温冰箱中的速冻地龙样本放入盛有液氮的研钵中，快速研磨至粉末状，按照基因组DNA提取试剂盒提供的提取步骤对其进行DNA提取，提取完毕，经过0.8%琼脂糖凝胶进行130V电压电泳检测30min，以此来判断提取的DNA样本是否降解，筛选有清晰条带的样本作为备用。使用紫外分光光度法，测定波长在260nm和280nm处的吸光度，估测DNA样本质量，检测λ260/.λ280值是否符合实验要求(1.6～1.8)，将筛选好的样本稀释至50μg/μL的样本保存在-20℃冰箱内，为ISSR-PCR反应备用。

2.2 ISSR-PCR反应体系建立

此次试验应考虑的不稳定性因素有ISSR引物、Taq聚合酶、模板DNA，通过对各因素的处理与优化，从而确定ISSR-PCR最佳反应体系。反应体系和初始程序参照文献[9]，总反应体系为20μL。反应程序为：94℃预变5min；94℃变性30s，54.6℃退火30s，72℃延伸1min，循环38次；72℃延伸10min，4℃保存。反应产物经过1.6%琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳缓冲液为1×TBE，在50V电压下电泳140min左右，溴化乙锭(EB)染色30min，DNA Marker(DL2000)标记，用紫外线凝胶成像分析仪(购自上海培清科技有限公司)观测，拍照，保存。

2.3 模板DNA浓度的优化

随机选取同一解链温度(Tm=52.2℃)的8个引物用作反应引物(UBC#807、#812、#813、#816、#819、#822、#825、#828)，设定模板DNA浓度为50、25、10 μg/μL作为待筛选的模板DNA样本，经观察对比获取模板DNA最佳浓度。

2.4 引物的筛选及其退火温度的优化

将筛选好的模板DNA浓度作为体系最佳模板DNA浓度，对100条ISSR引物进行筛选，根据检测结果选择ISSR-PCR反应体系最佳引物，同时利用最佳体系对ISSR引物退火温度进行梯度试验，梯度温度设定在引物解链温度上下浮动3℃，对每个退火温度梯度扩增的结果进行观察对比，确定ISSR引物最佳退火温度。

2.5 稳定性试验

另取10份同种地龙原动物模板DNA对ISSR-PCR最佳反应体系的稳定性进行检测，反应程序同上。

3 实验结果

3.1 模板DNA不同浓度对ISSR-PCR反应体系的影响

如图1所示，第1、4、7、10、13、16、19、22号均未有扩增条带产生，表明ISSR反应体系在模板DNA浓度为50 μg/μL时均没有发生扩增；第2、5、8、11、14、17、20、23号均能产生条带，但清晰度与特异性较低；第3、6、9、12、15、18、21、24号扩增的条带清晰度最好，特异性高，因此，确定10 μg/μL为ISSR反应体系模板DNA最佳浓度。

3.2 ISSR引物的筛选以及其退火温度的优化

以图2为例，由图可知，第13号和第18号均未出现扩增条带，第4、10、15、16、17号有较少的扩增条带，第1、3、5、6、12、14号有扩增条带，但背景不清晰，多态性低，第2、9、11号扩增的条带背景清晰，多态性高，特异性好，因此第2号的引物807、第9号引物825和第11号的引物810被选为ISSR最佳引物，最适退火温度分别为52.2、55.2、52.2℃。经筛选，确定引物807、810、818、825、826、827、829为ISSR反应最佳引物，以及最佳引物的最佳退火温度，见表1。

M-Marker DL 2000；1～3、4～6、7～9、10～12、13～15、16～18、19～21、22～24对应的引物分别是807、812、813、816、819、822、825、828

1、4、7、10、13、16、19、22对应的DNA浓度为 50μg/μL，2、5、8、11、14、17、20、23是25 μg/μL，3、6、9、12、15、18、21、24对应的是10 μg/μL

图1 模板DNA不同浓度对ISSR-PCR反应体系的影响

M-Marker DL2000；1～3、4～6、7～9、10～12、13～15、16～18对应的引物分别是807、816、825、810、814、817

1、4、7、10、13、16对应的退火温度为49.2℃，2、5、8、11、14、17为52.2℃，3、6、9、12、15、18为55.2℃

表1 ISSR-PCR反应最佳引物及其最佳退火温度

3.3 最佳反应体系的稳定性分析

根据确定的ISSR-PCR最佳反应体系，用10个同种地龙模板DNA进行稳定性分析试验，从图3的结果来看，确定的ISSR最佳反应体系稳定性高，可为后续实验所用。

M-Marker DL2000

4 讨论

ISSR分子标记鉴定技术作为一种新型的分子标记技术，具有多态性水平高，重复性好，安全性高，成本低的特点，虽然比其他鉴定分析技术更有准确性和稳定性，但仍存在多种不稳定性因素(ISSR引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA)影响着鉴定结果，因此在选用ISSR分子鉴定前期，应考虑分析各影响因素，筛选ISSR反应最佳引物，摸索ISSR引物最佳退火温度，从而确立地龙ISSR-PCR最佳反应体系。

本实验采用单因素设计试验建立了ISSR-PCR最佳反应体系，通过筛选最佳引物及摸索其最佳退火温度，从而将ISSR-PCR反应体系进一步优化。最佳反应体系为：反应总体积20μL，其中有10U Taq酶，0.8μmol/L引物，10ng/μL 模板DNA，加灭菌水补足至20μL，引物UBC807、UBC810、UBC818、UBC825、UBC826、UBC827、UBC829为ISSR反应最适引物，最适退火温度分别为52.2、52.2、55.2、55.2、54.6、54.6、54.6℃。实验发现，模板DNA浓度、引物及其退火温度的选择对ISSR反应结果有着重要的影响，为后续ISSR技术开展地龙遗传多样性的实验研究提供了依据。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社，2010，113

[2]武金霞，赵晓瑜.蚯蚓体内生物活性成分的研究[J].自然杂志，2004,26(1):27-30

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[4]李婷，林文津，徐榕青，等.ISSR技术在药用植物种质研究中的应用[J].中国民族民间医药，2010，(1)：41-42

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