单国辉李 伟

(1长春中医药大学附属医院内分泌科，长春130021；2黑龙江省佳木斯市中医院，佳木斯154002)

消渴脂平胶囊对糖尿病大鼠脂肪组织MCP-1影响的研究

单国辉1李 伟2

(1长春中医药大学附属医院内分泌科，长春130021；2黑龙江省佳木斯市中医院，佳木斯154002)

目的 本研究主要观察消渴脂平胶囊对高脂饲料与链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠模型脂肪组织MCP-1表达水平的影响。方法 复制糖尿病大鼠模型分为正常组、模型组、消渴脂平组及马来酸罗格列酮组。灌胃8周后采用免疫组化技术，从蛋白水平观察各组脂肪组织中MCP-1表达的情况。结果 ①消渴脂平胶囊可降低大鼠FPG及CRP水平。②糖尿病大鼠脂肪组织中MCP-1蛋白表达情况：正常组脂肪组织MCP-1表达强度较弱、范围小；模型组脂肪组织MCP-1表达显著增强；马来酸罗格列酮组脂肪组织MCP-1表达较模型组减弱；消渴脂平胶囊组脂肪组织MCP-1表达较模型组减弱，与马来酸罗格列酮组接近。半定量分析结果显示：正常组局部弱染，模型组弥漫性染色增强，马来酸罗格列酮局部染色趋强，消渴脂平胶囊组局部弱染，显著低于模型组。结论 ①消渴脂平胶囊具有降糖和改善炎症状态的作用。②糖尿病大鼠脂肪组织中MCP-1蛋白表达水平升高，提示MCP-1可能是促进肥胖T2DM发生发展的重要炎症因素；消渴脂平胶囊可降低糖尿病大鼠脂肪组织中MCP-1蛋白表达。

消渴脂平胶囊；脂肪组织；MCP-1；糖尿病；中医药疗法

现代研究表明，T2DM是一种自然免疫和慢性低度炎症性疾病，与临床常见的病毒、细菌引起的炎症反应不同，它是机体的一种微炎症状态。但其具体作用在哪个靶器官及其作用机制，尚未明确。近些年来研究表明，单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)在T2DM脂肪组织炎症发病中起着重要作用。随着社会的发展，糖尿病的病机由阴虚燥热逐渐演变为气阴两虚挟痰瘀，因此治疗上应以益气养阴、化瘀泻浊为主。

本实验以高脂饲料与链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠模型为实验对象，观察消渴脂平胶囊对血糖、CRP的影响，并采用免疫组化从蛋白水平观察各组大鼠脂肪组织中MCP-1表达的情况，以初步探讨T2DM的脂肪组织炎症反应，揭示消渴脂平胶囊在炎症方面的作用，以丰富T2DM的炎症机制学说，进一步阐释现代消渴“气阴两虚挟痰瘀”病机理论，为中医药防治T2DM提供新的途径及临床药物，并为深入探讨T2DM的炎症发病机制提供理论及实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择清洁级4周龄雄性Wistar大鼠48只，体质量(200±20)g，由吉林大学动物实验质量检测中心提供，许可证编号：SCx K-(吉)2007-0003。大鼠在吉林大学医学研究所实验动物中心无特定病原体(specific pathogen-free，SPF)级动物饲养房每笼5只饲养，环境温度控制在22-25°C，湿度为55±5%，12／12小时光照黑暗循环(光照时间7：00-19：00)，自由获取食物和饮水。

1.2 实验药物

1.2.1 消渴脂平胶囊 由山楂、何首乌、黄精、葛根、人参、泽泻、桑叶组成。长春中医药大学附属医院制剂中心提供。

1.2.2 马来酸罗格列酮片（文迪雅） 葛兰素史克(天津)有限公司提供，批号：国药准字H20020475。

1.2.3 链脲佐菌素（STZ） 德国Sigma公司生产。用时配成2%STZ溶液，按30mg／kg对大鼠进行腹腔注射。

1.3 高脂饲料配方 糖类占20%，猪油占10%，胆固醇占2%，胆酸盐占0.5%，普通饲料占67.5%。

1.4 主要仪器 ①DG-3022A酶联免疫检测仪(国营华东电子管厂)；②日立7150型生化自动分析仪(日本)。

1.5 主要试剂 ①Rabbit Anti-MCP-1：北京博奥森生物技术有限公司；②多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine)：福州迈新生物技术开发有限公司；③S-P超敏试剂盒(鼠／兔)：福州迈新生物技术开发有限公司；④DAB显色试剂盒：福州迈新生物技术开发有限公司。

1.6 实验方法

1.6.1 分组 选择Wister大鼠48只，适应性喂养1周后，按随机数字表分成正常组12只和高脂组36只。正常组喂普通饲料，高脂组喂饲高脂饲料。4周后参照Srinivasan等［1］和周迎生等［2］的方法造模，腹腔注射2%链脲佐菌素30mg／kg，腹腔注射等体积的0.1mol·L-1无菌枸橼酸缓冲液。所有大鼠于72h时眼眶取血，分离血清，-20℃冰箱冷冻保存备用，待测FPG、CRP。将造模成功的大鼠随机分为模型组、消渴脂平胶囊组、马来酸罗格列酮组，每组12只，每笼5只。分组后每天定时灌胃1次。消渴脂平胶囊组按3.6g／kg·d，马来酸罗格列酮组按4mg／kg·d灌胃，正常组及模型组均给予等体积蒸馏水灌胃。给药8周后将大鼠处死取脂肪组织，进行相关指标的检测。

1.6.2 Wistar大鼠DM诊断标准 腹腔注射链脲佐菌素7天后禁食不禁水12h，尾静脉取血，以Accu-chekAdvantage血糖仪测定血糖值。以血糖峰值＞16.7mmol／L诊断为DM。

1.6.3 一般状态观察 包括动物精神状态、毛色、死亡等情况。

1.6.4 血清FPG、CRP检测 灌胃结束后，大鼠隔夜禁食不禁水12h，次晨眼球取血，静置2小时后，3000r／min离心20分钟后，分离血清，移至-20℃冰箱冷冻保存备。

1.6.5 MCP-1蛋白检测 ①采用免疫组织化学染色法检测MCP-1蛋白表达情况。②脂肪组织MCP-1蛋白表达半定量评分：每只动物随机观察20个不重复的100倍视野，按脂肪细胞染色区域和染色强度分为0～4分：0分为无染色或染色极弱；1分为局部弱染，染色区＜25%；2分为局部染色趋强，染色区25%～50%；3分为弥漫性染色增强，染色区51%～75%；4分为弥漫性强染色，染色区＞75%。

综合免疫组化染色区域大小和染色强度，判定评分。

1.7 统计方法 采用SPSS13.0软件作统计分析，实验数据计量资料以均数±标准差(χ±s)表示，服从正态分布的两组间均数比较用t检验进行统计，同批次多组间比较采用单因素方差分析(One-wayANOVA)，两两比较采用最小显著差法(LSD)。

2 结果

2.1 一般情况 实验期间死亡动物9只，其中正常组1只，消渴脂平胶囊组2只，马来酸罗格列酮组2只，模型组4只。正常组大鼠生长良好，无其他症状。模型组大鼠较其他三组肥胖，活动迟缓、懒动、毛色干枯无光泽。

2.2 C-反应蛋白的比较 实验周期内，模型组显著高于正常大鼠组，具有非常显著性差异(P＜0.01)，消渴脂平胶囊组明显低于模型组(P＜0.01)。马来酸罗格列酮组与模型组相比无明显降低(P＞0.05)。

2.3 各组血糖水平的比较 实验周期内，模型组显著高于正常大鼠组(P＜0.01)，治疗组明显低于模型组(P＜0.05)，但均高于正常组(P＜0.05)。

2.4 大鼠脂肪组织中MCP-1蛋白表达情况 免疫组化结果显示：MCP-1免疫反应阳性产物为棕黄色颗粒，主要表达于细胞胞质内。正常组脂肪组织MCP-1表达强度较弱、范围小。模型组脂肪组织MCP-1表达显著增强。马来酸罗格列酮组脂肪组织MCP-1表达较模型组减弱。消渴脂平胶囊组脂肪组织MCP-1表达较模型组减弱，其MCP-1表达程度与马来酸罗格列酮组接近。

3 讨论

糖尿病属中医“消渴病”范畴，其典型症状为“三多一少”。但目前临床上许多2型糖尿病病人并没有“三多一少”症状，而是以肥胖为主要表现，造成了消渴病与糖尿病的含义不相符合。其原因在于中医以症状来命名消渴，而糖尿病的定义是以血糖值为诊断标准。消渴病的阴虚燥热病机理论是在三消论基础上提出的，并不包括无典型三多一少症状的糖尿病。现代糖尿病患者由于社会环境因素及应用大量降糖药物，其“三多一少”症状已不明显，而表现为肥胖，倦怠乏力，失眠多梦，舌质紫暗，苔腻等气阴两虚挟痰瘀之象。因此现代消渴病的证型多以气阴两虚挟痰瘀为主。古代医家治疗消渴病主要以滋阴清热为大法，但现代消渴病以气阴两虚挟痰瘀为多见，因此治疗上应以益气养阴，化瘀泻浊为主。“益气养阴，化瘀泻浊”是根据肥胖2型糖尿病病机特点所采用的具有针对性的治法。

消渴脂平胶囊(人参15g，黄精20g，何首乌20g，葛根20g，山楂15g，泽泻10g，桑叶20g)。本方以人参为君药。人参味甘、苦，性微温，归心、肺、脾经。具有大补元气，补脾益肺，生津止渴之功。《神农本草经》谓其“补五脏，安精神”。臣以黄精、何首乌。黄精味甘，性平，归肺、脾、肾经。具有滋肾润肺，补脾益气之功。《名医别录》：“主补中益气，安五脏”。《本草纲目》：“补诸虚，止寒热”。《本草正义》：“补血养阴，而养脾胃是其专长”。何首乌味甘、涩，性微温，归肝、肾经，具有补益精血之功。《本草纲目》：“此物养血益肝，固精益肾”。此资先天以养后天。二药合用共奏滋补脾肾之功。山楂味酸甘，性微温，归脾、胃、肝经，入血分。具有消食化积，行气散瘀作用。《本草纲目》：“化饮食，消肉积，痰饮”。《本草求真》：“山楂所谓健脾者，因其脾有食积，用此酸咸之味，以为消磨，俾食行而痰消”。葛根味甘、辛，性凉，归脾、胃经。具有生津止渴之功。《神农本草经》：“主消渴，身大热”。《药性论》：“止烦渴”。桑叶味甘、苦，性寒，归肺、肝经。《神农本草经》：“主寒热，出汗”。泽泻味甘、淡，性寒，归肾、膀胱经。具有利水渗湿，泄热之功。《神农本草经》：“消水，养五脏，益气力”。《本草纲目》：“渗湿热，行痰饮”。桑叶质轻宣上焦，津液得以布散，《温病条辨》：“治上焦如羽，非轻不举”。葛根升发脾胃清阳之气，清阳升，浊邪降。泽泻利下焦之湿，三药配伍合用，使痰浊之邪从三焦水道而出，三焦畅达，津液循于常道，与山楂合用，共奏佐药之功。

通过本实验表明消渴脂平胶囊可降低糖尿病大鼠血糖及CRP水平，说明消渴脂平胶囊具有干预炎症的作用。实验结果显示：模型组大鼠腹腔脂肪组织中MCP-1蛋白表达及半定量水平升高，提示MCP-1可能是促进肥胖T2DM发生发展的重要因素，但具体作用机制尚不明确。因此加大对MCP-1等炎症因子的研究可能为防治糖尿病指明新方向。本实验提示“气阴两虚挟痰瘀”是肥胖T2DM的病机核心，“益气养阴、化瘀泻浊”是肥胖T2DM的治疗大法。消渴脂平胶囊可降低糖尿病大鼠脂肪组织内MCP-1的表达，提示MCP-1是该药的作用靶点之一，并初步证实了肥胖T2DM“气阴两虚挟痰瘀”病机理论与现代医学炎症学说相符合，为进一步探讨肥胖T2DM的发病机制奠定了理论及实验依据。

［1］Srinivasan K，iswanad B，srat L，WT7.5BX〛et al.Combination of high-fat diet-fed and low-dose streptozotocin-treated rat：amodel for type 2 diabetes and pharmacological screening［J］.Pharmacol Res，2005，52(4)：313-230.

［2］周迎生，高妍，李斌，等.高脂喂养联合链脲佐菌素注射的糖尿病大鼠模型特征［J］.中国实验动物学报，2005，13(3)：154-158.

Research on the impact of MCP-1 in adipose tissue of diabetic rats by Xiaokezhiping Capsules

Shan guohui1li Wei2
（1 Affiliated hospital of Changchun university of traditional Chinese medicine，Changchun，130021，China；2 Jiamusi City hospital of Traditional Chinese medcine，Jiamusi，154002，China）

Objective In this study，lipid levels observed Xiaokezhiping Capsule on high-fat diet and streptozotocin-induced diabetic rat model of adipose tissue MCP-1 expression levels.Methods Diabetic rats were divided into normal group，model group，Xiaokezhiping capsules group，Rosiglitazone maleate group.After 8 weeks，fed by immunohistochemical techniques，adipose tissue was observed in each group MCP-1 protein expression levels from.Results ①Xiaokezhiping Capsules can reduce FPG and CRP levels in rats；②MCP-1 protein expression of adipose tissue in diabetic rat：MCP-1 expression of normal adipose tissue has weak intensity，small-scale；Significantly enhanced MCP-1 expression in adipose tissue of model group；Rosiglitazone maleate group MCP-1 expression in adipose tissue compared with the model group decreased；MCP-1 expression in adipose tissue compared with the model group decreased in Rosiglitazone maleate group；MCP-1 of adipose tissue in Xiaokezhiping Capsule group compared with the model group decreased，close to rosiglitazone maleate group.Semi-quantitative analysis showed that：Its local is stained weakly in normal group，Diffuse stained strengly in model group，Its local is stained strengly in Rosiglitazone maleate group，Local weak staining in in Xiaokezhiping Capsule group was significantly lower than the model group.Conclusion ①Xiaokezhiping Capsule take a role of reducing blood sugar and improving inflammation；②It may be important to promote the development of inflammatory factors in obese T2DM，because MCP-1 protein levels of adipose tissue in diabetic rat increased.Xiaokezhiping Capsule can reduce Capsule MCP-1 protein expression in adipose tissue of diabetic rats.

Xiaokezhiping Capsules；Adipose tissue；MCP-1；Diabetes；Traditional Chinese medicine therapy

10.3969／j.issn.1672-2779.2014.03.098

1672-2779(2014)-03-0151-03

苏 玲文校对：朴春丽

2013-10-08)