■王庆吉 唐 薇 罗亚军 陈立颖 王 晋 张 蕾 刘海洋 王晓兰 关洪斌

（山东大学海洋学院，山东威海264209）

研究表明，刺参的免疫能力及存活率与自身的蛋白质的含量有极为密切的关系。因此我们决定从根源着手，对刺参的食物中蛋白质的含量进行测定研究，探究其与刺参的生长免疫能力以及成活率之间的关系。为了排除动物蛋白中其它活力因子对研究的影响，试验采用了富含蛋白的植物饲料。希望通过此项研究能够对刺参市场的科学饲养有所帮助，为提高刺参的存活率提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料与条件

实验研究用的刺参全部为购自山东省威海市永泰刺参养殖场的1龄参。体长为6～7 cm，活泼健康，雌雄兼备共计120只。将其平均分配到4个相同的塑料周转箱内进行饲养(箱体长60 cm、宽45 cm、高50 cm)，每个箱内放置有两片瓦片(用海水清洗并浸泡了48 h)及一块取自海里的石头，而且每个箱内还都配备有一个氧气泵(用以不断供氧)、一支温度计(随时测定水温)。

1.2 实验方法

1.2.1 饲料的准备

海泥粉来自威海市荣成成山海参养殖场；市售海藻粉：山东滨州产，主要成分鼠尾藻、马尾藻、海青菜、海草；浒苔和大叶藻采自威海市小石岛海滩；火棘果采自威海市山东大学校园。用摘去杂质洗净高温烘干，于高速中药粉碎机ZN500A粉碎过60目筛，冰箱保存备用。用海藻、浒苔、火棘果、大叶藻这四种含高蛋白的植物作为饲养刺参的饵料，分别投放到刺参1组、2组、3组、4组。

1.2.2 饲养管理

将刺参进行1周驯化饲养后，放在实验室环境中饥饿24 h，测定各组海参的初体重，每日定时投饵、换水、清理粪便，不断充氧，保持水体氧含量、pH值、盐度、温度等适宜且稳定。

1.2.3 清理及换水

每天换水前用虹吸法抽取箱底及石头和瓦片表面的刺参排泄物及饵料残渣，测定残食量。每天下午2:30准时进行换水，每次抽出箱内总水量的三分之一，再加入等量的静置了48 h并用六层纱布过滤过的清澈海水。

1.2.4 投饵

每天投喂一次，换水后进行，采用饱食量投喂法，每天以海参体重的3.0%称取饵料，4个水箱分别投放四种不同的饵料。先用处理好的清澈海水将容器内的饵料搅匀，而后均匀的全部撒入水箱内。

1.3 测定数据

1.3.1 过氧化酶（CAT）活性的测定

用紫外吸收法进行CAT活性的测定。

式中：ΔA240——As0-(As1+As2)/2;

As0——加入失活酶液的对照管吸光值；

As1，As2——样品管吸光值；

Vt——粗酶提取液总体积（ml）；

Vl——测定用粗酶提取液体积（ml）；

FW——样品鲜重（g）；

0.1——A240每下降0.1为1个酶活单位（U）；

t——过氧化氢到最后一次读数时间（min）。

本实验以1 min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位(U)。蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法[4]。

1.3.2 超氧化物歧化酶（SOD）活力测定

采用氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶（SOD）活力。

式中：A——酶活力[酶活力单位/(g·h)]；

V——酶提取液体积（μl）；

B——一个酶活力单位的酶液量（μl）（抑制NBT光还原的相对百分率为50%时所加入的酶液量，以该酶液量作为1个酶活单位）；

W——样品鲜重（g）；

T——反应时间（min）。

1.3.3 溶菌酶含量的测定

用溶菌酶检测试剂盒（南京建成）进行含量测定。

1.4 数据统计与分析

利用Excel与Spss对实验数据进行统计分析，用单因素方差分析（one-way ANOVA）及卡方检验进行统计学分析；P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 实验结果

2.1 蛋白含量不同的刺参饵料中的蛋白含量

分别喂食海藻粉、浒苔粉、火棘果粉、大叶藻粉的刺参体壁蛋白的含量情况如图1所示。四种饵料本身的蛋白含量如图2所示。从实验结果很容易看出，喂食不同的饵料，刺参体壁蛋白的含量各不相同，其中喂食大叶藻的刺参(即第四组)蛋白含量与其它组的刺参的蛋白含量有显著的差异（P＜0.05），而且体壁蛋白含量与饵料蛋白的含量成正相关，饵料中蛋白的含量直接影响刺参体壁蛋白的含量，二者之间有紧密的联系。

图1 四种饵料中蛋白质的含量

图2 刺参体壁蛋白质含量

2.2 蛋白含量不同的刺参的重量

平均从每个箱内抽取5只生长相对较好的刺参进行称重（防止随机抽取而取到已排肠的刺参），喂食四种饵料的海参的重量如表1所示。喂食大叶藻的刺参的体重显著高于其他组（P＜0.05）。喂食火棘果粉的刺参体重也相对较大，但生长的不均匀。而喂食海藻粉和浒苔粉的刺参的体重则差距不大。

表1 喂食不同饵料的刺参的重量（g）

2.3 蛋白含量不同的刺参CAT、SOD的活性及溶菌酶的含量

蛋白含量不同的刺参CAT、SOD的活性及溶菌酶的含量如图3～图5。从图中可以看出SOD的活性以及溶菌酶的含量各组间有显著差异（P＜0.05），SOD活性以及溶菌酶的含量整体变化趋势与刺参蛋白含量变化相同，而CAT的活性无明显差异（P＞0.05），这里不予探究。

图3 刺参中SOD活性

图4 刺参中溶菌酶含量

图5 刺参中CAT活性

2.4 蛋白含量不同的刺参的成活率

蛋白含量不同的刺参的成活率如图6，从图6可以看到，4组刺参的成活率的变化趋势与刺参蛋白的含量相同。这也可以进一步说明了刺参蛋白质的含量与免疫能力有着密切关系。

图6 四组刺参的成活率

3 讨论

刺参属于海洋棘皮动物，其免疫防御机制是通过细胞和体液免疫反应共同完成的。目前试验检测发现，构成刺参的主要营养成分中蛋白质的含量所占的比重是最大的。作为生长所需要的营养素之一，蛋白质的含量与刺参的生长有着极为密切的关系，并且能在一定程度上反映出刺参生长能力及免疫能力，因此研究刺参饵料中蛋白质含量对刺参生长时体内蛋白含量的影响进而可以了解饵料中蛋白含量对刺参免疫能力的影响。此项研究不仅对开发新型饵料配方以增强刺参的免疫能力，提高存活率进而提高经济效益具有重要意义，同时也能为刺参的免疫机制的研究提供一定的基础资料。

蛋白质是刺参生长所必需的营养物质，同时也是刺参的免疫系统的重要组成部分，其含量的多少一定程度上决定了机体免疫能力的大小，与机体的免疫力相关。本实验的结果表明，食物中蛋白质的含量越大，刺参的蛋白含量就越高，个体生长的也越大。这说明机体发育的较好。但是当蛋白质超过一定的限度，免疫能力却不随之一直升高。本实验过程中，在刚开始喂养的过程中，食物中蛋白含量过高，刺参反而容易生病，喂食大叶藻的幼参即第4组，在实验开始的第一周内，死亡数目明显高于其他组。这一结果与李勇等的研究结果一致，这很可能是由于饵料中过高的蛋白含量不仅会加重动物机体代谢负担，抑制免疫活性的发挥，而且会大大增加机体的氮排泄量，导致水体污染，进而降低免疫能力，提高感染疾病的几率。

蛋白质也是机体免疫反应的直接参与者，许多实验证实，一些蛋白质水解产生的小肽对动物的体液免疫和细胞免疫可产生有利的影响。Krogdahl等研究发现，小肽可提高海洋生物白细胞的呼吸爆发能力，增加超氧离子的产量，加强对异物的杀灭作用。有实验表明，小肽可以显著增强海洋生物的非特异性免疫能力。同样也有实验指出，饵料中的蛋白被分解成氨基酸继而被吸收，而机体内氨基酸的含量、种类以及它们之间的配比也会显著影响刺参的免疫功能，然而针对特定的氨基酸和机体免疫的相关性，仅有少量报道，且多数研究集中在特定的氨基酸营养对机体生长效果的作用方面。本实验中，选用了蛋白含量不同的4种饵料。一定范围内蛋白越多，进入刺参体内分解的也就越多，刺参的免疫力也就越强。但是，超过一定范围，蛋白含量由于过高，其蛋白的三级结构有可能过于复杂而不易被分解，所以免疫力不强，我们的实验结果也与此相同。但是，在喂这组高蛋白饲料中存活下来的刺参即第四组刺参，生长发育却明显要好于其他三组，更不容易生病，对于这种结果，作者认为是生长发育好的刺参其消化系统得到进一步的完善，所以蛋白含量过高的食物也容易被消化，可被机体利用，机体的生长也就更好，免疫力更强。从这种角度看，我们的结果也与Krogdahl等的结论相同。

SOD是无脊椎动物机体内的重要的抗氧化酶，它能够及时清除吞噬细胞呼吸爆发产生的活性自由基，从而使机体免受损伤。CAT普遍存在于植物的所有组织中，所以可以随饵料进入到机体内，CAT的活性可影响机体代谢强度及抗病能力。

本实验中，SOD活性随着刺参体内蛋白含量的升高而增大，这说明了随着刺参的不断生长发育，SOD逐渐增多，抗氧化作用不断增强，SOD逐渐成为主要的抗氧化酶，刺参的免疫能力也逐渐增大，这一结果与田丹等研究结论相同。刺参体内的CAT含量比较均一，各组之间并没有太大差异，无明显现象，故在这里不予探讨。

溶菌酶是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用，其本质是一种蛋白质。实验数据显示，刺参内溶菌酶的含量与蛋白质的含量有明显的联系，蛋白质含量高于其它组的刺参溶菌酶的含量也会高于其它组。溶菌酶的相对分子质量约为16 000，与常见金属离子和化学试剂有良好的配伍性。有实验证明从刺参中分离纯化的溶菌酶具有广谱杀菌功能，即对常见的革兰氏阴性菌和阳性菌细胞壁均有溶菌作用。这一点也证明了溶菌酶对刺参免疫力的重要性。

4 结论

本次实验着重研究了4种蛋白含量不同的植物饵料对刺参生长和免疫及存活率的影响。前人于此少有报道。通过本次实验研究，使用蛋白含量不同的饵料饲喂的刺参蛋白质的含量明显不同，免疫能力存在着显著地差异，尤其是SOD活性及溶菌酶活性的差别较为明显。这说明食物中的蛋白不仅可以保证刺参健康发育成长，同时也能促使刺参体内的免疫系统的各项重要的免疫组分趋于成熟，使免疫功能更加健全完善，从而形成良性循环，刺参能更好地吸收食物中的养分，使刺参能更健康地发育成长。