PEG接枝氧化石墨烯的制备与细胞成像

2014-01-02徐国强徐鹏武施冬健陈明清

无机化学学报 2014年9期

徐国强徐鹏武施冬健陈明清

(江南大学化学与材料工程学院，食品胶体与生物技术教育部重点实验室，无锡 214122)

自Novoselov和Geim等[1]制备出单层石墨烯以来，其在电化学、传感器和复合材料等领域的应用受到广泛关注[2]。石墨烯有大的比表面积，可通过范德华力、π-π堆叠等非共价键合作用高效吸附芳香族化合物[3-4]，因此作为载体也成为研究热点。氧化石墨烯(GO)表面随机分布着大量的羟基、羧基和环氧基等含氧官能团，较石墨烯有更好的亲水性[5]，经功能分子的共价修饰可实现其在特定领域的应用[6-9]。荧光素(Flu)的量子产率高且激发与发射波长范围广，适用于荧光标记和探针[10]，GO可作为荧光物质的载体用于生物医药领域[11-14]。Flu与GO的非共价键合作用会引起荧光猝灭[15-16]，因此以聚乙二醇(PEG)桥接GO和Flu防止荧光猝灭，增强GO基荧光探针的溶液分散稳定性，实现细胞成像。

本工作将不同分子量的PEG在相同的反应条件下接枝到GO表面，研究PEG的接枝量对GOPEG分散稳定性的影响；以GO-PEG为载体，探讨PEG的接枝量对Flu负载量的影响，考察Flu/GOPEG6000在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中的释放行为；以接枝PEG键合Flu，观察GO-PEG6000-Flu的细胞成像效果。

1 实验部分

1.1 主要试剂与仪器

氧化石墨，实验室制备；透析袋 (MWCO=14 kDa)，购于国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、荧光素、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、聚乙二醇(PEG1000、PEG2000和 PEG6000)均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司；N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)和4-甲氨基吡啶(DMAP)均为分析纯，购于阿拉丁试剂(上海)有限公司；胎牛血清和细胞培养基(DMEM)购于南京凯基生物科技发展有限公司；HepG2肝癌细胞购于上海博谷生物科技有限公司。

所用仪器有：FALA2000-104型傅里叶变换红外光谱仪 (加拿ABB Boman公司)，InVia型拉曼光谱仪(英国Renishaw公司)，UV-1100型紫外-可见分光光度计 (北京瑞利分析仪器公司)，RF-5301PC荧光光谱仪(日本岛津公司)，TGA-1100SF型热重分析仪(瑞士Mettler-Toledo公司)，S-4800型场发射扫描电子显微镜(日本日立公司)，DB-525型zeta电位及粒度分析仪(美国Brookhaven公司)，LSM710型共聚焦激光显微镜(德国Zeiss公司)。

1.2 GO-PEG的制备

取Hummers法[9]制备的氧化石墨在DMF中超声分散，得到1 mg·mL-1的分散液，将100 mg PEG1000、200 mg PEG2000和 600 mg PEG6000分别与 50 mL分散液加入100 mL圆底烧瓶中超声10 min，再加入一定量DCC/DMAP(物质的量的比5∶1)，超声30 min后在60℃下反应12 h，将分散液装入透析袋中透析1周，除去游离的PEG和催化剂，经冷冻干燥得GO-PEG。

1.3 Flu/GO-PEG的制备

在 5 mL 不同浓度(3.2～28.8 μg·mL-1)的 Flu 溶液中加入0.5 mL GO水分散液(0.1 mg·mL-1)，室温下搅拌24 h。离心30 min后，由标准曲线测出上层清液中未负载的Flu，进而计算出Flu在GO上的负载量。以相同的方法计算出Flu在GO-PEG的负载量。

1.4 Flu的释放

将Flu/GO-PEG6000装入透析室中，置于盛有20 mL不同pH值(5、7.2和9.18)磷酸盐缓冲液(PBS)的烧杯中，在37℃恒温下透析3 d，在设定的时间点从烧杯中取出3 mL PBS，并立即补充3 mL PBS，在475 nm波长下测定取出溶液的吸光度，根据标准曲线计算出Flu的释放率。

1.5 GO-PEG6000-Flu的制备

取 1 mg·mL-1GO-PEG6000的 DMF 分散液、5 mg Flu 和 DCC/DMAP (物质的量的比 2∶5∶1) 装入 100 mL圆底烧瓶，超声20 min后置于60℃下反应24 h，将体系透析一周，经冷冻干燥得到GO-PEG6000-Flu。

1.6 细胞培养与观察

37℃、5%CO2条件下，在盛有10%胎牛血清的DMEM培养液中培养HepG2细胞，将30 μg·mL-1GO-PEG6000、Flu/GO-PEG6000和 GO-PEG6000-Flu 分别加入HepG2细胞培养液中培养24 h，将细胞移植到24孔板中，继续培养6 h，用PBS漂洗3次，将细胞置于载玻片上，加90%甘油-PBS封片，于共聚焦激光显微镜(CLSM)下观察(激光波长460 nm)。

2 结果与讨论

2.1 GO-PEG的结构与形貌表征

图1为GO(a)和GO-PEG(b～d)的红外谱图。GO在～3 400 cm-1附近吸收峰较宽，包含COOH和O-H的吸收，～1 718 cm-1处峰为C=O的伸缩振动峰。经PEG 修饰后，～2 880 cm-1和～1 095 cm-1处出现了PEG的C-H和C-O的振动吸收峰，～1 724 cm-1处为接枝PEG后形成酯键的振动峰，～1 248 cm-1处为PEG的C-O-C的非对称弯曲振动，表明PEG接枝成功。

图1 (a)GO、(b)GO-PEG1000、(c)GO-PEG2000和(d)GOPEG6000的红外谱图Fig.1 FTIR spectra of(a)GO,(b)GO-PEG1000,(c)GOPEG2000and(d)GO-PEG6000

图2 (a)石墨、(b)GO、(c)GO-PEG1000、(d)GO-PEG2000和(e)GO-PEG6000的拉曼光谱图Fig.2 Raman spectra of(a)Graphite,(b)GO,(c)GOPEG1000,(d)GO-PEG2000and(e)GO-PEG6000 under a laser excitation wavelength of 532 nm

图2是石墨(a)、GO(b)和 GO-PEG(c～e)的拉曼光谱图。1 350 cm-1、1 579～1 605 cm-1附近的峰分别代表D带和G带。相较石墨，GO的G带变宽并发生蓝移，ID/IG明显增加，原因是石墨的氧化过程降低了石墨层的sp2杂化程度，使石墨层的缺陷和混乱程度增加，蓝移由孤立的双键引起[17-20]。GO-PEG的ID/IG与GO相比略有增大，但总体变化不大，表明PEG的接枝对其面内sp2领域大小的影响不大。

GO和GO-PEG的 TGA曲线(图 3)显示，GO(a)在N2气氛下低于100℃的热失重归因于水分的蒸发，～160℃处显著的热失重归因于GO表面含氧官能团的热分解[19]。 GO-PEG(b～d)在～200 ℃为表面剩余含氧官能团的热失重，250～400℃为接枝PEG的热失重，根据其热失重的变化，可计算出PEG的接枝量与接枝密度[21]分别为14.2%、18个PEG1000链/10000 碳 (b)，52.5%、66 个 PEG2000链/10000 碳(c)，68.4%、43个 PEG6000链/10000碳(d)。

图3 (a)GO、(b)GO-PEG1000、(c)GO-PEG2000和(d)GOPEG6000的TGA曲线Fig.3 TGA curves of(a)GO,(b)GO-PEG1000,(c)GOPEG2000and(d)GO-PEG6000in nitrogen

图4(a)显示经超声剥离所得GO是径厚比较大的卷曲的薄片，但仍有一定程度的聚集。经PEG修饰后，PEG对GO片层间的范德华力和氢键的弱化作用有利于GO片层的剥离与延展以及阻止GO的聚集[22-23]，所以 GO-PEG 的形貌(图 4b～d)及静置状态下的分散稳定性发生了明显的变化(图5)。GO-PEG剥离程度高于GO；GO-PEG6000分散稳定性最佳，30天仍可稳定分散在PBS中(图5d)，表明产物的分散稳定性与接枝量呈一定的正相关。

图4 (a)GO、(b)GO-PEG1000、(c)GO-PEG2000和(d)GOPEG6000的SEM照片Fig.4 SEM images of(a)GO,(b)GO-PEG1000,(c)GOPEG2000and(d)GO-PEG6000

2.2 GO-PEG的负载功能

图5 (a)GO、(b)GO-PEG1000、(c)GO-PEG2000和(d)GOPEG6000在PBS中的分散稳定性(1 mg·mL-1)Fig.5 Stability of(a)GO,(b)GO-PEG1000,(c)GO-PEG2000 and(d)GO-PEG6000in PBS(1 mg·mL-1),photograph of samples on selected time(inset)

图6中a→h的变化趋势表明随着GO-PEG6000用量的增大，由Flu与GO-PEG6000的碳平面间的非共价键合作用引起的荧光猝灭作用逐渐增强，荧光强度逐渐减弱。GO和GO-PEG对Flu的负载量如图 7 所示，Flu 浓度达到 28.8 μg·mL-1时，其负载量在 1.4～1.9 mg·mg-1，高于许多负载体系[4,24]。GO 具有最大的负载量；经PEG修饰后，GO-PEG的负载量受其表面接枝量的影响而不同，其中GO-PEG1000的接枝量最小，载药面积受影响程度最小，对Flu的负载量达 1.75 mg·mg-1。

图6 GO-PEG6000用量增加对Flu溶液荧光强度的影响Fig.6 Fluorescence intensity of Flu solution as a function of GO-PEG6000amount(from a to h:10,30,50,70,90,100,110 and 120 μL),with the excitation wavelength of 460 nm

图7 不同Flu浓度下载体的负载量Fig.7 Loading capacity of carriers in different Flu concentrations,standard curve of Flu(inset)

图8 Flu/GO-PEG6000的释放行为Fig.8 Release behaviors of Flu/GO-PEG6000

通过分散稳定性(图5)和负载(图7)实验可知，GO-PEG6000兼具良好的分散稳定性与负载性能，因此以Flu/GO-PEG6000为研究对象，其在37℃、不同pH值PBS中的释放行为如图8所示。在不同pH值条件下，起始阶段均具有较快的释放速率，12 h后释放速率放缓；碱性条件下具有更快的释放速率，其原因是Flu的羟基和羧基与载体表面残留羧基及羟基间的氢键作用受到破坏，而酸性与中性环境对此类氢键的影响较小，这与模型药物罗丹明在石墨烯基负载上呈现的pH响应释放相异[3,14]。Flu可作为一种模型药物为研究结构类似药物的pH响应释放提供一定的理论支持。

2.3 GO-PEG6000-Flu的细胞成像功能

图9 (a)GO-PEG6000-Flu，(b)GO-PEG6000和(c)Flu的红外谱图Fig.9 FTIR spectra of(a)GO-PEG6000-Flu,(b)GO-PEG6000 and(c)Flu

图10 GO-PEG6000-Flu的尺寸分布Fig.10 Size distribution of GO-PEG6000-Flu,SEM image of GO-PEG6000-Flu(inset)

图11 (a)Flu、(b)GO-PEG6000-Flu、(c)Flu/GO-PEG6000和(d)GO-PEG6000水溶液的荧光光谱Fig.11 Fluorescence spectra of(a)Flu,(b)GO-PEG6000-Flu,(c)Flu/GO-PEG6000and(d)GO-PEG6000 solution,photograph of samples(inset)

图9为GO-PEG6000-Flu(a)和Flu(b)的红外谱图。a谱线中，944 cm-1、843 cm-1处出现归属于Flu芳环中C-O-C和C=C的特征峰，另外，相较于GOPEG6000，Flu的键合引入了新的 C=O，可以看到～1 724 cm-1处IC=O明显增强，可表明GO-PEG6000-Flu合成成功。经多次离心分离、超声分散后可得到尺寸较小的GO-PEG6000-Flu分散液(图10)，其荧光发射光谱如图11(b)所示，与Flu(a)相比发生了～10 nm的红移，而Flu/GO-PEG6000(c)发生了荧光猝灭；表明PEG的桥接有效防止了GO片层对Flu的荧光猝灭作用，同时导致发射波长发生转变，有望作为一种荧光探针。为了考察GO-PEG6000-Flu荧光探针的细胞成像功能，将 GO-PEG6000、Flu/GO-PEG6000、GOPEG6000-Flu分别加入HepG2细胞培养液。通过CLSM对细胞进行观察，结果如图12所示。摄入Flu/GO-PEG6000的HepG2细胞因其荧光猝灭作用导致荧光显像不清晰(B1，B3)，摄入 GO-PEG6000-Flu的细胞荧光显像效果较显著(C1，C3)，能较清晰地看到细胞，表明探针通过细胞的内吞作用进入细胞质。同时，该探针具有较好的细胞相容性，在测试过程中未见明显的细胞凋亡现象。

图12 (A)GO-PEG6000、(B)Flu/GO-PEG6000和(C)GOPEG6000-Flu标记的HepG2细胞的CLSM图片,1表示暗场,2表示明场,3表示明暗场重叠Fig.12 CLSM images of HepG2 cells incubated with(A)GO-PEG6000,(B)Flu/GO-PEG6000and(C)GOPEG6000-Flu,Dark-field(1),bright-field(2)and overlap of the two fields(3),scale bar:20 μm