贺胜男，樊彦恩，武 帅，杨良保，刘洪林*

1.中国电子科技集团公司第三十八研究所，安徽合肥，230088；2.中国科学院合肥智能机械研究所纳米功能材料与传感器件研究中心，安徽合肥，230031

随着经济全球化进程的不断深化，食品安全问题已经成为一个全球性的问题，食品安全事件的发生呈不断上升趋势。在发生的各种类型食物中毒中，以细菌性食物中毒最为多见，并对人群健康造成严重危害。因此，快速查明中毒原因，不仅有利于对重症患者的抢救治疗，而且对采取有效措施，最大限度地预防和控制细菌性食物中毒的发生具有极为重要的意义。目前，检测食品致病菌的方法主要有常规检验技术、免疫血清方法、基因探针、PCR 技术和生物芯片检测技术等。这些技术的操作步骤比较繁琐，检测时间从数天到数小时，而且对样品的要求很高，具有一定的局限性。因此，研发廉价、便携、快速测定、具有自主知识产权的食品安全检测技术、方法和仪器意义重大。

单壁碳纳米管(SWNTs)因其出色的电学性能、高比表面积以及对表面吸附事件的极大灵敏性等特点，被广泛应用于传感器的换能元件以检测各类生物分子。然而，基于SWNTs的传感器的重复制备依然是限制该领域进一步发展的主要问题，因为在两个方面存在困难：(1)抗体抗原相互作用的信号放大。(2)抗体在SWNTs表面的固定。SWNT-Au复合材料具有增强电导和分子传感的能力。然而，Au纳米颗粒的一些特性，比如：量子化的充电/放电[1]、隧道效应[2]、轻松且稳定地连接许多分子或基团的能力[3]、生物相容性和保留吸附抗体免疫活性的能力[4]，均表明Au纳米颗粒功能化的SWNTs可能在未来纳米器件的制造中具有广阔的应用前景。通常有两种方法把Au纳米粒子装饰到碳纳米管(CNT)上：间接或直接沉积[5]。对于间接沉积，一层偶联分子(如聚合物涂层)介于CNT和Au纳米颗粒之间[6]；直接沉积是指不借助任何其他分子或基团的连接，直接把Au纳米颗粒装饰到CNT的侧壁上，比如金属蒸气法、溶剂化金属原子分散法等[7]。一般情况下，SWNT-Au结合界面的连接主导着CNT通道的电学行为，不同方法杂化的SWNT-Au材料的电学性质可能存在巨大的差异。因此，研究更加稳定和简便的SWNTs和Au纳米颗粒杂化方法并探索其电学行为对信号放大能力和超灵敏生物检测的影响是一个重要的课题。

本文首次发展了一种新颖的SWNTs与Au纳米颗粒的杂化方法，即在O2等离子体处理和空气气氛中500℃高温热处理方法的辅助下，简便地制备了SWNT-Au复合网络换能器。O2等离子体氧化的SWNTs可以高密度且均一地组装正电荷Au纳米颗粒。空气气氛下的高温热处理过程，不仅去除了SWNTs表面吸附的所有杂质，使得叉指金电极(8 μm间距)和SWNTs网络之间形成了良好的接触。另外，该处理导致Au纳米颗粒表面熔化并产生聚集，使残余的SWNTs管束变细。热处理引起的变化极大地改变了换能器的电流-电压行为，并放大了其对抗体-抗原相互作用事件的敏感性。本文利用此方法制备了抗体功能化的免疫传感器，检验了抗原-抗体的相互作用系统，即利用特异性抗体功能化的传感器选择性地检测李斯特氏菌溶血素(Listeriolysin，简写为LLO)。在5 min培育时间内，免疫传感器的检测限可以达到2 ng·mL-1左右。

1 SWNT-Au复合物的制备程序和抗原的电学检测原理

首先，SWNTs在O2等离子体气氛中氧化10 min，通过相转移方法合成直径约8 nm的正电荷Au纳米颗粒，并与O2等离子体氧化的SWNTs溶液混合，形成Au纳米颗粒在SWNTs表面的高密度组装。其次，预先纯化的SWNT-Au水溶液大约10 μg·mL-1，滴涂到叉指金电极上(电极以覆盖有1 μm SiO2绝缘层的Si片为基底，叉指间距8 μm，叉指电极厚度300 nm)，在室温下干燥。将制备的SWNT-Au复合物网络薄膜覆盖的叉指电极置于管式炉中，在空气气氛、500℃高温(温升速率10℃·min-1)下培育5 min，以去除杂质(如无定形碳等)并烧结Au纳米颗粒使其紧密结合到SWNTs表面，同时使得叉指电极与SWNT-Au复合网络之间有良好的接触。另外，用50 μL的抗体母液覆盖制备的SWNT-Au网络，通过Au表面与抗体中氨基和巯基等基团的固有相互作用，把抗体固定到SWNT-Au网络上。最后，为了阻断和封闭非特异性结合位点并钝化未包覆的SWNTs，抗体功能化的SWNT-Au网络进一步浸入含0.5% BSA和0.5% Tween 20的PBS缓冲液中培育2 h，即制备成所需要的生物免疫传感器，如图1所示。

图1 SWNT-Au复合物的制备程序及相关图

图1(A)功能化SWNT-Au复合物的制备程序：首先，SWNTs在O2等离子体气氛中氧化10 min; 接着，正电荷Au纳米颗粒再氧化SWNTs表面的高密度组装;然后，铺展在叉指微电极表面的SWNT-Au复合物网络在500℃、空气气氛中处理5 min;然后，抗体在SWNT-Au复合物网络上的固定; 最后，抗体功能化的SWNT-Au复合物网络浸入含0.5% BSA和0.5% Tween 20的PBS溶液，封闭和钝化非特异性结合位点。(B)SWNT-Au复合网络用于制作免疫传感器的示意图。(C)所制备的免疫传感器在抗原结合前(实线)和结合5 min(短线)以及30 min(点线)的电流-电压曲线。(D)所制备免疫传感器叉指电极的SEM图。

在制备的传感平台中，换能元件是桥接微电极叉指间隔的SWNT-Au复合物随机网络，而传感元件即固定的抗体。利用抗体和相应抗原间的特异性分子识别能力实现了对目标分析物LLO的快速、高灵敏和特异性检测。

2 免疫传感器制备、信号测试及电学行为分析

2.1 免疫抗体及抗原的制备

安徽医科大学微生物学研究所提供了本文所需要的抗体、抗原等生物材料： LLO (2.73 mg·mL-1)以及其兔多克隆兔抗体(anti-LLO)。最终获得的抗体、抗原等生物材料保存于磷酸缓冲液(pH=7.4)中。抗体、抗原的识别通过Western-blotting测试予以确认。所获得的抗体、抗原等溶液在使用前未进行任何处理。

2.2 微电极的制备

传感器的微电极是在实验室的洁净室中，在Si基底上采用标准蚀刻法制作的。利用化学气象沉积法(CVD)在(100)取向的Si片上先沉积1 μm厚度的SiO2层以隔绝基底。光刻确定电极区域后，一层Cr支撑层和一层约300 nm厚度的Au层通过电子束蒸发到硅片上。最后通过剥离技术获得微电极(图2)，所制备的叉指微电极的叉指间距为8 μm。

图2 采用MEMS工艺在Si/SiO2基底上制作的叉指微电极的实物照片

2.3 SWNT-Au复合材料的制备及表征

直径8 nm的正电荷Au纳米颗粒的制备是依据Gittins等人报道的相转移方法[8]。未加工的SWNTs通过温和的O2等离子体处理使其表面功能化。O2等离子体氧化装置是在实验室手工搭建的[9]，等离子体发生器通过一个射频电感耦合等离子体诱导，O2等离子体点火前，反应器压力保持在2.0 Pa，纯O2气通过一个针阀进入反应器。压力到5 Pa时，通过13.56 MHz和功率50 W的射频进行等离子体点火，在持续搅拌条件下，使用O2等离子体对SWNTs进行氧化处理10 min。然后，将2 mg氧化的SWNTs置于1 mL水中，超声30 min后，在4 000 rpm下离心20 min。上清液转移进一个新管，加入1 mL正电荷Au纳米颗粒混合，持续超声1 h。再以16 000 rpm的转速离心30 min，弃上清，沉淀即是合成的SWNT-Au复合物，利用双蒸水重悬并离心洗涤三次，最后超声分散在1 mL双蒸水中，即制备成所需要的SWNT-Au复合材料。图3是所制备SWNT-Au复合物的透射电镜(TEM)表征。Au纳米颗粒和SWNTs之间的相互作用是强烈、牢固的，2 h的超声并未引起可分辨的形貌变化。

图3 SWNT-Au复合物的TEM图

2.4 免疫传感器制作

免疫传感器的制作包括三个步骤：滴涂SWNT-Au复合材料，热处理和SWNT-Au复合物的功能化。第一，滴1 μL SWNT-Au复合物的悬浮液在电极间隙中，并在室温下干燥，其中图4A和B显示的是SWNT-Au复合物滴涂到微电极表面后的扫描电镜(SEM)表征。第二，将SWNT-Au复合物薄膜覆盖的微电极置于管式炉中，500℃空气条件下培育5 min，温度上升的速率为10℃·min-1(图4C和D)。第三，50 μL的抗体母液覆盖住热处理后电极上的SWNT-Au复合物薄膜，4℃下保持12 h。金表面与抗体中氨基和巯基基团的强烈相互作用把抗体固定在Au纳米颗粒上，从而实现电极的功能化。第四，抗体功能化的电极用PBS工作液洗涤后，浸入含0.5% BSA和0.5% Tween 20的PBS溶液中，培育2 h，封闭掉SWNT-Au复合物上的非特异性结合位点。另外，为了验证所制备传感器的选择性，本文也进行了功能化修饰过程的对照试验，即用1%的BSA代替抗体修饰热处理后的电极，其他步骤保持不变。

图4 微电极表面铺展的不同浓度SWNT-Au复合物在500℃热处理前(A，B)和处理后(C，D)的形貌变化

在传感器制作中，选择在500℃的高温下热处理的最初目的是要最大程度地去除SWNTs表面的杂质而又不大量损毁SWNTs的结构(图4)。在500℃条件下，SWNT-Au的总质量损失是7%，也就是总SWNTs质量的七分之一。500℃热处理使Au纳米颗粒的直径变大到20 nm，一些甚至大于50 nm，同时颗粒密度极大地降低，每100 nm长的SWNT-Au框架结构中，从大约80个纳米颗粒降到4个纳米颗粒。SEM图显示大部分Au纳米颗粒是在SWNTs骨架的上方，并排列成反映SWNTs走向的长的网络状。当尺度接近纳米水平时，Au纳米颗粒的熔点远低于其块体熔点[10]。在500℃时，该尺寸依赖的表面熔化效应导致小的Au纳米颗粒在SWNTs表面的聚集[11],使它们在远低于其熔点的温度就发生了形状转变，最终导致SWNTs表面相当低的颗粒密度[12]。烧结的SWNT-Au能与微电极表面形成牢固的接触[13]。另外，烧结的Au纳米颗粒和SWNTs表面之间的距离比先前表面修饰基团介导的静电组装的间距小，这可能是烧结的SWNT-Au网络具有幂率(Power-law)电流-电压行为的重要因素，关于这点，将会在后文中进行详尽的讨论。

3 免疫传感器的快速、高灵敏检测

3.1 对李斯特氏菌溶血素的检测

图5显示的是所制备的免疫传感器及测试的等效电路。将同一个免疫传感器在不同浓度抗原溶液中培育不同的时间。每次培育后，传感器用双蒸水漂洗，在室温下干燥后用于电学测试。电流-电压(I-V)曲线的采集通过皮安表(Keithley 6487， USA)，偏压范围-1～1 V，采集间隔0.01 V。

图5 制备的一组免疫传感器实物图(左)及用于电学信号检测等效电路图(右)

图6给出了传感器在制作和对LLO的传感检测过程中不同阶段的电学响应。类似的，热处理导致SWNT-Au复合物网络呈现幂率I-V行为(图6曲线a)，anti-LLO的固定(图6曲线b)导致SWNT-Au网络电流响应的减小。随后的BSA和Tween 20的封闭同样引起传感器电流响应的减小(图6 曲线c)。

将免疫传感器浸入LLO浓度为2.73 ng·mL-1的PBS (pH=7.4)溶液中，培育5 min，传感器电阻增加了56.4%，是测量标准偏差(±15%)的3倍以上(图6 曲线d和图7)。20 min的培育引起电阻增加了2.6倍。抗体抗原的反应培育1 h左右，达到近乎饱和时，传感器电阻增加了近4.3倍。

上述结果表明，抗体功能化修饰的免疫传感器对于对应的抗原具有良好的传感检测能力，可以分辨抗原结合，从而导致电阻变化，能够实现短时间内对抗体抗原相互作用事件的免疫检测。同时，该免疫传感器的制作方法在生物分子免疫检测方面具有广阔的应用前景。

图6 传感器在制作和对LLO传感检测过程中不同阶段的电学响应

注：(a)热处理后SWNT-Au网络的I-V响应;(b)anti-LLO抗体功能化SWNT-Au网络的电学响应;(c)用含0.5% BSA和0.5% Tween 20的PBS封闭2 h后的电学响应;(d)～(e)免疫传感器在2.73 ng·mL-1的LLO中分别培育5分钟和1小时后的电学响应。

图7 anti-LLO功能化的免疫传感器在2.73 ng·mL-1的LLO溶液中培育不同时间引起的电阻变化

3.2 免疫传感器的电学行为分析

如前所述，500℃、空气气氛中的热处理能够增强吸附并定位纳米管。另外，高温热处理改变了SWNT-Au网络的形貌，使得SWNTs变细，而变细的SWNTs可能会有利于引起SWNT-Au网络可调谐的、各向异性的电子传输特性[14]。Au纳米颗粒的表面熔化和聚集，导致其与SWNT表面的牢固接触，根据金属和纳米管各自的功函数大小不同，电子可以很容易从纳米管向金属转移或者反过来，这可以导致电子传输特性的显著改变。当Au沉积到SWNTs表面上时，在金属-纳米管接触界面上，它们费米能级的差异使得电子发生转移，平衡该费米能级差异。文献报道，Au的功函数大概是5.0～5.22 eV[15]，而纳米管的功函数大概是4.7～5.0 eV[16]。因此，Au沉积后，电子从纳米管向Au转移，从而使纳米管表现出更多的p-型特性。SWNTs在费米能级附近具有很窄的态密度，载流子密度很小的变化可能会显著影响纳米管的费米能级，而费米能级的变化将会引起电导的变化。

如果SWNTs具有低水平的诱导缺陷，它就可以作为弹道导体(Ballistic conductor)[17]。通常情况下，源极以及漏极接触的肖特基势垒(Schottky barrier)显著地控制着纳米管通道的电导，而SWNTs上的缺陷可以作为散射中心，并引起相应的量子势垒(Quantum barrier)。在热处理后的SWNT-Au网络中，可以推测除了SWNT与Au的结合界面外，其中的大部分缺陷已经被烧掉。也就是说，烧结形成的Au纳米颗粒充当了量子点[18]。量子点的表现类似库伦岛(Coulomb islands)，它们表现出单电子充电效应，即库伦阻塞(Coulomb blockade)以及零维限制效应(zero-dimensional confinement effect)，极大地决定了器件的电阻特性[18]。载流子可以在SWNTs内以弹道方式传导，然而多重共隧穿传输也存在于Au纳米颗粒网络中[19]。Voggu等人计算结果显示，SWNTs与Au纳米颗粒之间相互作用能的大小与它们之间的距离呈负相关，说明是库伦相互作用。因为Au纳米颗粒可以负载电子，它的局域静电势肯定对源漏整体静电势具有反方向的效应，公式表达如下。

(1)

其中，EC是单个库伦岛的库伦充电能(Coulomb charging energy)；d是粒子半径；e是电子电荷；ε0是自由空间介电常数；ε是环境介质的介电常数。

对于弹性共隧穿(Elastic cotunneling)，I正比于V。当载流子连续通过一行共j个结的非弹性共隧穿时(Inelastic cotunneling)，电流表达式如下[19]。

(2)

其中，V是跨越j个结的整体偏压，gT是单个结的隧穿电容，kBT是热活化能(Thermal activation energy)。当附加较大的偏压使其超过整体的库伦阻塞阈值时，I-V特性即表现为幂率行为，公式2预测I-V的关系为I正比于V1+2(j-1)，如图6中所示电流电压曲线。

4 结束语

本文利用等离子体和热处理辅助的方法制备了SWNT-Au复合物随机网络，应用于叉指微电极并制备成免疫传感器，成功地进行了抗体—抗原相互作用事件的快速、高灵敏和选择性的检测。由于Au纳米颗粒的共隧穿效应和Au纳米颗粒引起的SWNTs能带调制，热处理过程使SWNT-Au复合物网络产生了幂率电流电压行为，极大地改善了所制备传感器对于抗体—抗原相互作用事件检测的稳定性和敏感性。通过用anti-LLO功能化所制备的传感器，实现了对LLO的快速、高灵敏检测，在5 min的培育时间内，检测限能达到2 ng·mL-1左右。另外，所制备的传感器成本相对低廉、便携，且适合大范围的筛选测试。考虑到世界范围内不断增加的致病菌污染事件，本文提供的致病菌检测方法，不论是在节约个人还是公共卫生健康的开支方面具有重要意义。

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