陈德良 ，王少扬，黄德东，陈 剑

（1.福建中医药大学，福建 福州 350122；2.南京军区福州总院，福建 福州 350025）

乙型肝炎病毒（HBV）特异性CD8+T细胞（CTL）介导的细胞免疫应答在控制HBV感染和病毒清除中至关重要，而辨证分型是中医治疗慢性乙型肝炎（CHB）的基础，慢乙肝不同中医证型与特异性CTL应答之间可能存在一定相关性。本研究通过对中医辨证分型为湿热中阻型和肝郁脾虚型CHB患者的PBMC在体外经特异性抗原和混合肽段诱导下CTL应答效应的观察，探讨HBcAg、HBsAg、混合肽段对其CTL细胞应答的影响，为慢性乙型肝炎免疫治疗及中医辨证分型提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要抗体及试剂 人重组 HBcAg、HBsAg、混合肽段（HBcAg18－27，5′-FLPSDFFPSV-3′；HBcAg60－68，5′-VCWGELMNL-3′；HBsAg183-191，5′-FLLTRILTI-3′）及植物血凝素（PHA）购于上海宝曼生物科技有限公司；人IFN-γ ELISPOT试剂盒及相关产品及人淋巴细胞分离液（Ficoll-PaqueTM PLUS）购自美国Sigma公司。

1.2 一般资料 选择2012年3月—2013年3月南京军区福州总院感染科病房及门诊CHB湿热中阻型和肝郁脾虚型患者各30例。西医诊断标准参照2005年12月10日颁布的 《慢性乙型肝炎防治指南》［1］，中医诊断标准参照1991年天津会议制定的《病毒性肝炎中医辨证标准》［2］。排除既往进行过抗病毒治疗及HAV、HEV、HCV等病毒感染和其他原因（药物、酒精、中毒）造成的急慢性肝损害患者。2组患者在性别、年龄、病程等方面比较经统计学检验，无显著性差异（P＞0.05），具有可比性，见表1。

表1 2组一般资料比较（）

表1 2组一般资料比较（）

组 别湿热中阻组肝郁脾虚组男21 20 n 30 30女91 0年龄／岁27.47±6.40 29.40±6.93病程／a 9.63±4.52 10.40±4.40

1.3 生化、乙肝血清标志物及HBVDNA定量检测肝肾功能采用全自动生化仪检测，乙肝血清标志物采用酶联免疫法，HBVDNA检测采用荧光定量PCR法检测。以上检测均在我院检验科完成。

1.4 人外周单个核细胞（PBMC）的分离和细胞因子IFN-γ ELISPOT检测 无菌采静脉血10 mL，用泛影葡胺密度梯度法分离PBMC，并用RPMI 1640完全培养液将细胞浓度调至1×106个／mL，按照ELISPOT试剂盒的说明书操作。先用含10%胎牛血清的PRMI 1640培养基封闭ELISPOT预包被板1 h，临用前倒掉封闭液，加入1×106个／mL人的PBMC（直接用新鲜的PBMC）100 μL。CHB肝郁脾虚和湿热中阻组加入 20 μg／mL 的混合肽段、HBcAg、HBsAg 各 100 μL 诱导，阳性参照组加入 4 μg／mL 的 PHA 100 μL进行诱导，在细胞培养箱内培养26～36 h后，在每孔中加入100 μL预冷的去离子水，并在4℃下放置10 min，倒掉液体，用洗涤液洗涤5～7次，每次放置30～60 s，最后一次在吸水纸上扣干。然后向每孔中加入生物素标记的anti-IFN-γ单抗，37℃孵育1 h，倒掉液体，用洗涤液洗涤5次，每次放置30～60 s，最后一次在吸水纸上扣干。加入检测二抗，在37℃孵育1 h，倒掉液体，用洗涤液洗涤5次，每次放置30～60 s，最后一次在吸水纸上扣干。最后加入显色剂显色15～30 min，待出现斑点后立即用自来水冲洗终止反应。ELISPOT板晾干后用斑点读板仪计数，并记录斑点数，计算IFN-γ数量以SFC／105PBMC表示，做统计学分析。

1.4 统计学处理 采用SPASS16.0进行数据统计分析，两样本均数比较用t检验，多个标本均数比较用方差分析。

2 结 果

2组PBMC经HBcAg、HBsAg、混合肽段诱导产生IFN-γ数量比较 见表2。

表2 2组PBMC经不同诱导物诱导产生IFN-γ 数量比较（）SFC／105PBMC

表2 2组PBMC经不同诱导物诱导产生IFN-γ 数量比较（）SFC／105PBMC

注：与肝郁脾虚组比较，1） P＜0.05；与 HBsAg比较，2） P＜0.05；与混合肽段比较，3） P＜0.05。

HBcAg 37.60±2.561）2）3）31.27±2.032）3）组 别湿热中阻组肝郁脾虚组HBsAg 14.33±1.261）10.37±1.47 n 30 30混合肽段14.17±1.621）10.57±1.94

3 讨 论

慢性乙型肝炎是严重影响我国人民健康的传染病，是导致肝硬化肝癌的主要原因。据估计目前我国有乙肝病毒携带者9千万人以上，有2千万以上慢性活动性肝炎患者需要治疗。现国内外公认的乙肝抗病毒治疗措施主要是干扰素和核苷（酸）类药物，前者有效率仅在40%左右，并存在明显毒副作用；后者虽然有明显的抗病毒作用，但存在耐药和停药后复发的局限性，故探寻更有效的治疗措施十分必要。HBV特异性CTL应答效应已有大量试验证明是HBV感染后慢性化和病情发展的关键因素。在急性自限性HBV感染者多表现为强的多克隆的HBV特异性CTL应答效应，相反在慢性乙肝患者多表现弱的寡克隆的HBV特异性CTL应答效应，甚至部分患者缺失［3］，通过调节HBV特异性CTL应答是治疗慢性乙型肝炎主要途径。中医中药在调理人体免疫功能方面有独到的优势，而中医辨证分型又是中医诊断和治疗疾病的基础，所以探讨慢性乙型肝炎的中医辨证分型与HBV特异性CTL应答效应相关性，有可能找到中西医结合治疗慢性乙型肝炎的切入点。本实验共收集慢性乙型肝炎中医辨证分型为湿热中阻型和肝郁脾虚型各30例，通过对不同抗原和混合肽段的观察，乙肝核心抗原作为最强的抗原可诱导较明显的HBV特异性CTL应答，在不同的抗原诱导下湿热中阻型和肝郁脾虚型相比，前者表现出较明显的HBV特异性CTL应答效应。以上结果提示：如果通过合理的有效的中西医结合免疫调节治疗，湿热中阻型慢性乙肝患者可能会取得明显的疗效而肝郁脾虚型患者还需要更强的免疫调控措施打破已存在的免疫耐受。国内部分学者通过不同指标检测或者不同的辨证分型就慢性乙肝免疫状态与辨证分型相关性也进行了探讨，如王见义等［4］就慢性乙肝湿热中阻型、肝肾阳虚和肝肾阴虚型中CD8+T细胞和CD4+／CD8+比值进行比较，结果3型CD8+细胞计数逐渐降低而CD4+／CD8+比值逐渐升高，提示不同中医证型间存在免疫学差异。冯建英等［5］就慢性乙型肝炎的虚证和实证与CTL应答效应也做了分析，提示实证CTL应答效应高于虚证，但低于健康对照组。我们按国内公认的中医辨证分型进行分型入组，并选择相对常见的2型作为研究对象，就不同抗原诱导CTL效应进行观察，为今后选择更有效的免疫诱导剂打下理论基础。当然中医辨证目前还存在不同分型方法，CTL应答效应特别是特异性CTL应答效应的检测方法还需要进一步改进和完善。

［1］中华医学会肝病学分会、感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南［S］.实用肝脏病杂志，2006，9（1）：8-18.

［2］中国中医药学会内科肝病专业委员会第四次学术会议.病毒性肝炎中医辨证标准［S］.中医杂志，1992，33（5）：39—40.

［3］闫杰，谢雯，冯鑫，等.HBcAg特异性CTL在急性乙型肝炎与慢性乙型肝炎急性发作患者外周血中的数量差异［J］.世界华人消化杂志，2011，19（4）：404-406.

［4］王见义，韩向晖，王灵台，等.慢性乙型肝炎中医证型与免疫功能的相关性研究［J］.上海中医药杂志，2007，41（9）：35-36.

［5］冯建英，邵建国，陈琳，等.慢性乙型肝炎中医虚实辨证与机体特异性细胞免疫及病毒复制的关系探讨［J］.辽宁中医药大学学报，2013，15（8）：136-138.