周妍妍，刘艳丽，董春雪，闫景东

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

老年性痴呆，又称阿尔采末病(Alzheimer's disease，AD)，是发生在老年期及老年前期的一种原发性退行性脑病［1］，在发达国家，AD已成为继心脏病、癌症以及中风之后导致人类死亡的第4位原因。该病目前没有理想的治疗药物，给社会和家庭带来巨大的压力。中医传统理论认为五味子具有安神定志、益智强识之功效，经常应用到防治痴呆的中医经典方剂中(如地黄饮子、开心散、还少丹等)。五味子醇甲是五味子的重要有效成分，具有安定、镇静、抗惊活性，对大脑皮层的兴奋抑制过程具有调节作用［2－3］，但对其防治 AD 的作用及机制研究较少。本研究选取APP/PS1双转基因痴呆模型小鼠为研究对象，观察五味子醇甲对小鼠脑组织神经元变性、脱失及突触功能等的影响，为其防治AD提供依据。

1 材料

1.1 药品、试剂与仪器 SYP、α-syn免疫组化试剂盒:北京博奥森生物技术有限公司。五味子醇甲:成都曼斯特生物科技有限公司。盐酸多奈哌齐片:卫材(中国)药业有限公司，国药准字:H20070181。病理图像分析系统:cimas Med 6.0，麦克奥迪图像技术有限公司。

1.2 实验动物 ♂SPF级APP/PS1双转基因痴呆模型小鼠24只(编号:J004462，品系名称:B6C3-Tg［APPswe，PSEN1dE9)85Dbo/J］，南京大学模式动物研究所提供。同背景、同月龄的阴性小鼠8只。

2 方法

2.1 分组及给药方法 APP/PS1双转基因痴呆模型小鼠随机平均分为3组:转基因小鼠组、盐酸多奈哌齐组、五味子醇甲组，每组8只;阴性小鼠8只为野生型小鼠组。盐酸多奈哌齐组给予盐酸多奈哌齐片(0.66 mg·kg－1·d－1)灌胃，五味子醇甲组给予五味子醇甲(10 mg·kg－1·d－1)灌胃，转基因小鼠组给予等量生理盐水灌胃，共4周。

2.2 取材方法 灌胃结束后进行行为学测试，测试后断头处死，脑组织置于4%多聚甲醛中固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，常规切片。

2.3 HE染色 石蜡切片脱蜡至水，常规苏木精－伊红(HE)染色，树胶封片，显微镜下观察。

2.4 尼氏染色 石蜡切片脱蜡至水，1%甲苯胺蓝染色，酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片，显微镜下观察。

2.5 免疫组织化学 切片脱蜡至水;修复抗原;PBS冲洗;滴加一抗工作液(1∶300)，4℃过夜;PBS冲洗2 min×3次;滴加二抗工作液，室温20 min;PBS冲洗2 min×3次;DAB显色;苏木精复染;梯度酒精脱水，二甲苯透明、树脂封片，显微镜下观察。应用病理图像分析系统对切片进行分析，200倍下每张切片随机选取5个视野取平均值，将阳性目标总面积与统计场总面积的比值(面密度)作为统计数据。

3 结果

3.1 HE染色结果 野生型小鼠组可见神经细胞分布均匀，形态正常，层次清楚，核仁清晰;转基因小鼠组可见神经细胞排列紊乱、疏松，细胞数量明显减少，神经细胞萎缩，多见核深染、固缩现象;盐酸多奈哌齐组病理表现较转基因小鼠组有明显改善，仅见少量神经细胞萎缩。五味子醇甲组可见胶质细胞增多，部分神经元萎缩，但较转基因小鼠组明显改善(Fig 1)。

Fig 1 Observation of mice brain tissues by HE staining

3.2 尼氏染色 野生型小鼠组神经细胞质中可见大量着深蓝色呈斑块状尼氏小体;转基因小鼠组细胞内尼氏小体大量脱失，胞质内仅散在少量尼氏小体。盐酸多奈哌齐组、五味子醇甲组尼氏小体脱失较转基因小鼠组明显减少(Fig 2)。

Fig 2 Observation of mice brain tissues by nissl staining

3.3 免疫组化

3.3.1 各组小鼠脑组织中SYP的表达 转基因小鼠组脑组织SYP表达较野生型小鼠组明显减少(P＜0.01)，盐酸多奈哌齐组、五味子醇甲组较转基因小鼠组明显增加(P＜0.01)，差异有显著性(P＜0.05或P＜0.01)，盐酸多奈哌齐组、五味子醇甲组之间差异无显著性(Fig 3，Tab 1)。

Fig 3 Expression of SYP in mice brain tissues examined by immunohistochemical method

3.3.2 各组小鼠脑组织中 α-syn的表达 转基因小鼠组脑组织α-syn表达较野生型小鼠组明显增加(P＜0.01)，盐酸多奈哌齐组和五味子醇甲组较转基因小鼠组明显减少(P＜0.01)，盐酸多奈哌齐组、五味子醇甲组之间差异无显著性(Fig 4，Tab 1)。

Fig 4 Expression of α-syn in mice brain tissues examined by immunohistochemical method

4 讨论

APP/PS1双转基因痴呆模型小鼠脑组织出现神经细胞数量减少，神经元萎缩，胶质细胞增多、尼氏小体脱失等病理变化，五味子醇甲可明显改善其脑组织的病理改变，显示了其神经保护作用。SYP位于突触囊泡上，与突触结构和功能关系密切，其表达的水平可有效地反映突触的状态［4］。AD患者脑内的神经淀粉样变性可导致突触变性，SYP的含量降低，突触后反应减弱，最终导致突触传递障碍，从而引起记忆和认知功能下降，导致AD发生。在AD发病早期，突触数量减少比神经元丧失更显著，还伴有突触病理性变化［5］。所以，SYP是AD治疗的标志之一。本研究结果显示，转基因小鼠组脑组织中SYP明显降低，五味子醇甲可提高SYP的表达。αsyn是中枢神经系统突触前膜的小分子可溶性蛋白质，是AD患者脑内老年斑除Aβ以外的另一重要成分，但其在AD发病中的机制尚不完全清楚。目前认为可能是α-syn的增多和病理性聚集减弱了突触前囊泡的释放，干扰了神经元的轴浆转运，导致突触功能障碍。另外，有研究发现α-syn的病理性积聚可导致细胞的凋亡或死亡［6－7］。还有研究发现，APP转基因拟痴呆小鼠模型脑内 α-syn明显增加［8］，与本研究的结果相符合。本研究中APP/PS1双转基因痴呆模型小鼠脑组织中α-syn明显增高，五味子醇甲治疗后α-syn较模型组明显降低，表明降低α-syn可能是五味子醇甲防治AD的重要途径。

Tab 1 Effect of schisandrin on expression of SYP and α-syn in mice brain tissue(±s，n=8)

Tab 1 Effect of schisandrin on expression of SYP and α-syn in mice brain tissue(±s，n=8)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs transgenic mice group

Group SYP α-syn Wild Type group Transgenic mice group Donepezil hydrochloride group Schisandrin group 0.230 ±0.030＊＊0.163 ±0.021 0.211 ±0.030＊＊0.198 ±0.024*0.063 ±0.076＊＊0.110 ±0.011 0.080 ±0.007＊＊0.084 ±0.013＊＊

综上可见，五味子醇甲可通过减轻APP/PS1双转基因痴呆模型小鼠神经元变性、脱失，改善突触功能等途径起到防治AD的作用。

［1］吴彦霖，辛晓洁，辛现良，耿美玉.GXXXG结构对老年性痴呆相关蛋白功能调节研究进展［J］.中国药理学通报，2011，27(1):1－4.

［1］Wu Y L，Xin X J，Xin X L，Geng M Y.Research progress about the regulation of GXXXG structures in the Alzheimer-related protein［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(1):1－4.

［2］李海涛，胡 刚.五味子醇甲抑制6-羟基多巴胺诱导PC12细胞凋亡的研究［J］.南京中医药大学学报，2004，20(2):96－7.

［2］Li H T，Hu G.Study on the protective effects of schizandrin on 6-OHDA-induced apoptosis of cultured PC12 Cells［J］.J Nanjing Univ Tradit Chin Med，2004，20(2):96－7.

［3］王 蕾，唐 勇，黄 山.五味子乙素和五味子醇甲对PC12细胞氧化损伤的保护作用［J］.中国临床康复，2006，47(10):64－7.

［3］Wang L，Tang Y，Huang S.Protective effects of schisandrin B and schisandrin on oxidative damage in PC12 Cells［J］.Chin J Clin Rehabilitat，2006，10(47):64－ 7.

［4］Khvotchev M V，Sudhof T C.Stimulus dependent dynamic homo and hetero multimerization of synaptobrevin/VAMP and synaptophysin［J］.Biochemist，2004，43(47):15037－ 43.

［5］Jacobsen J S，Wu C C，Redwine J M，et al.Early-onset behavioral and synaptic deficits in a mouse model of Alzheimer's disease［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103(13):5161－6.

［6］Dev K K，Hofele K，Barbieri S，et al.PartⅡ:alpha-synuclein and its molecular pathophysiological role in neurodegenerative disease［J］.Neuropharmacol，2003，45(1):14－44.

［7］徐 杰，张国华，陶恩祥.利福平抑制 α-synuclein的聚集及对MPP+诱导细胞损伤的拮抗作用［J］.中国病理生理杂志，2006，22(10):2032－5.

［7］Xu J，Zhang G H，Tao E X.Rifampicin inhibits the expression and aggregation of α-synuclein and antagonizes MPP ～ +-induced PC12 cells damage［J］.Chin J Pathophysiol，2006，22(10):2032－5.

［8］Dewachter I，Van Dorpe J，Smeijers L，et al.Aging increased amyloid peptide and caused amyloid plaques in brain of old APP/V717I transgenic mice by a different mechanism than mutant presenilin1［J］.J Neurosci，2000，20(17):6452－8.