张 静，王洪新，杨 娟，鲁美丽，李胜陶，喻晓春

(1.辽宁医学院 辽宁省心脑血管药物重点实验室，辽宁，锦州 121001;2.中国中医科学院实验中心，北京 100700)

心肌肥厚(myocardial hypertrophy)是心脏对体内外各种刺激产生的一种适应性反应，随着疾病的进展，最终可导致心力衰竭［1］。β肾上腺素能受体是调节心脏功能的主要受体，其在心脏中的信号转导机制一直是研究的热点，β受体兴奋后导致炎症因子的活化，并且涉及多种心血管疾病［2］。研究发现异丙肾上腺素(Iso)诱导心肌肥厚的过程中涉及炎症反应，使机体炎症因子如白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等含量增加［3］。有证据表明黄芪多糖(astragalus polysaccharides，APS)具有一定的抗炎作用，可明显减少脂多糖诱导的人单核细胞株THP21中IL-6的表达及分泌［4］。本实验室已证明:① Iso可激活CaMKⅡ 信号通路诱导心肌细胞肥大［5］，② APS对Iso诱导心肌细胞肥大具有一定的保护作用［6］，其APS的剂量是本实验 APS的参考依据。然而APS是否通过抑制CaMKⅡ信号通路保护心肌及CaMKⅡ在Iso诱导心肌细胞肥大所致炎症反应中的作用，目前尚无报道。本实验运用 10 μmol·L－1的Iso为诱导剂［7］，进一步探讨APS对Iso诱导心肌细胞肥大的保护作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物、药品和试剂 出生1～3天的SD乳鼠，♀♂不拘，由辽宁医学院实验动物中心提供，动物合格证号:SCXK(辽)2003－0007。黄芪多糖为陕西森弗生物技术有限公司，批号:HQ090312，纯度98%;Iso、PRO、二甲基亚砜(DMSO)﹑十二烷基硫酸钠(SDS)﹑CaMKⅡ抑制剂KN93均购自美国sigma公司;低糖DMEM培养基购自Gibco公司;小牛血清购自美国Hyclone公司;RT-PCR试剂盒、引物、Marker均购自大连宝生物工程有限公司;CaMKⅡδ一抗购自Santa Cruz;IL-6、TNF-α ELISA 试剂盒购自 R＆D公司;其他试剂均为分析纯。

1.2 体外乳鼠心肌细胞原代培养 体积分数为0.75的乙醇消毒，无菌开胸，迅速取出心脏，置于盛有D-Hanks溶液培养皿中清洗，修剪心脏仅留心尖部分并剪成大小约为0.5～1.0 mm3的碎块，加入0.8 g·L－1胰蛋白酶溶液，37℃分次恒温消化，第一次10 min，弃上清，以后均为8 min，消化4～5次。将消化好的细胞置于体积分数为0.15小牛血清、0.84低糖DMEM和0.01双抗(含浓度均为100 U·L－1的青霉素和链霉素)吹打均匀后，装入25 cm2培养瓶(或24孔培养板)中，37℃，5%CO2孵箱中培养。采用差速贴壁法纯化心肌细胞，然后将细胞调至所需密度(培养瓶为5×106，培养板为5×105)置于孵箱中继续培养。

1.3 分组及给药方法 常规培养心肌细胞48 h后，为减少血清成分对实验结果的影响，更换体积分数为0.0004小牛血清的低糖培养基继续培养24 h，待细胞生长周期同步化后进行实验。实验所需药品Iso、APS和PRO均为水溶性，三蒸水溶解后0.22 μm针式滤器除菌;KN93溶于DMSO，为消除DMSO对心肌细胞的毒性作用，其在培养基中的体积分数需小于0.001。给药组APS、KN93和PRO预先孵育30 min，加入Iso，48 h后进行各指标的测定。实验共分为 8 组:①正常对照组;②Iso(10 μmol·L－1);③KN93(0.2 μmol·L－1);④Iso+KN93;⑤Iso+APS(0.1 mg·L－1);⑥Iso+APS(1 mg·L－1);⑦Iso+APS(10 mg·L－1);⑧Iso+PRO(2 μmol·L－1)。

1.4 心肌细胞体积的测定 取“1.3”处理的各组细胞，PBS快速冲洗长满细胞的培养孔，每孔加入质量分数为0.1% 的胰蛋白酶，放入37℃ 恒温箱中孵育10 min左右，随后每孔加入含体积分数为0.1×102血清的培养基终止消化。将同组细胞合并收集注入一细胞室内(该细胞室底部是一经硅化的盖玻片，防止心肌细胞贴壁)，在放大400倍的倒置显微镜下观察细胞，几乎呈球形。用计算机CIAS大恒细胞图像分析系统测量单个细胞的直径，进而计算出细胞的体积。每孔随机选择4个视野，每个视野测20个细胞。

1.5 心肌细胞总蛋白质含量的测定 取“1.3”处理的各组细胞，吸去各孔中的培养液，PBS溶液冲洗3次，加入SDS使细胞裂解，为减少去垢剂对实验结果的影响，SDS的含量应低于0.01%。根据计数，每孔细胞数约为5×105个，采用 Bradford法测定细胞的总蛋白含量。

1.6 ELISA法检测心肌细胞外液IL-6和TNF-α的含量 取“1.3”处理的各组细胞上清液，将试剂盒置于室温平衡30 min，按照ELISA试剂盒说明进行操作，完毕后在全自动酶标仪于450 nm波长读取吸光度值，绘制标准曲线，根据各标本吸光度值在标准曲线上得出相应的浓度。

1.7 RT-PCR法检测心肌细胞 ANP mRNA的表达 收集“1.3”处理的各组细胞，加入 TRIzol试剂800 μl裂解细胞，收集细胞裂解液，氯仿抽提，异丙醇沉淀，用DEPC处理水回收总RNA。以质量浓度为10 g·L－1的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计A260/A280鉴定RNA浓度和纯度，纯度以大于1.8为宜。取约1 μg总 RNA进行反转录。反转录条件为:30℃ 10 min;45℃ 30 min;95℃ 5 min。ANP 引物:up:5'-GGGCTCCTTCTCCATCAC-3'，down:5'-CCCTCAGTTTGCTTTTCA-3'(348 bp);内参GAPDH的引物序列为:up:5'-AATGCATCCTGCCACCACCAACTGC-3'，down:5'-CCAGGCCATGTAGTAGGCCATGAGGTC-3'(550 bp)。PCR反应条件:94℃45 s，55℃ 50 s，72 ℃ 1 min 15 s。循环扩增结束后，取10 μl产物进行质量浓度为20 g·L－1的琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后，置于凝胶成像系统进行观察和分析。

1.8 Western blot法测心肌细胞 CaMKⅡδ蛋白水平 收集“1.3”处理的各组细胞，BCA法蛋白定量。保证上样量相同条件下计算出每组应吸取样品上清的体积，用上样缓冲液补至 80 μl，再加 100 μl溴酚蓝染液煮沸4 min，然后各取10 μl样品以及蛋白质标准品点样，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。初始电压为90 V，观察 Marker的移动情况，适时终止电泳。转膜、封闭、洗膜，然后取所需部分与稀释过的一抗(1∶1 000)4℃杂交过夜，第2日用 TBST洗膜3次，然后室温与二抗作用至少1 h，再次洗膜3次，加ECL显色，上机检测。

1.9 统计学处理 采用 SPSS 16.0软件进行统计学分析，数据均以±s表示，采用单因素方差分析和LSD法。

2 结果

2.1 APS对心肌细胞形态学改变的影响 Fig 1显示，在倒置相差显微镜下观察，正常对照组心肌细胞呈梭形、三角形和不规则形，有突起，呈放射状排列;Iso组细胞较为饱满且明显肥大，可见少量细胞碎片;KN93组(CaMKⅡ抑制剂 )细胞形态与正常对照组无明显差异;Iso+KN93组和Iso+不同浓度黄芪多糖组均对肥大的心肌细胞有一定的改善作用，表现为细胞体积变小，细胞碎片减少，且黄芪多糖从低剂量(0.1 mg·L－1)、中剂量(1 mg·L－1)到高剂量组(10 mg·L－1)，保护作用依次增强，呈剂量依赖性。

2.2 APS对心肌细胞体积及蛋白含量的影响Tab 1显示，与正常对照组相比，Iso组心肌细胞体积增大了88.3%，总蛋白含量增加了55.3%;KN93组细胞体积和总蛋白含量未见明显改变，提示CaMKⅡ的抑制剂对正常心肌细胞无影响;与Iso组相比，Iso+KN93组、Iso+PRO组和黄芪多糖低、中、高剂量组心肌细胞体积分别减小了45.2%、44.7%、27.6%、35.2%、45.2%，细胞总蛋白含量分别降低了 33.9%、33.4%、13.5%、25.0%、34.7%;提示KN93组、PRO组和APS低、中、高剂量组均可对Iso诱导的心肌细胞肥大产生一定的抑制作用，且APS存在剂量依赖性。

Fig 1 Pictures of the cultured neonatal rat cardiomyocytes(×400)

Tab 1 Effects of different treatments on cell size and total protein content of cultured myocardial cells induced by Iso［±s，n=80(size)，n=6(protein)］

Tab 1 Effects of different treatments on cell size and total protein content of cultured myocardial cells induced by Iso［±s，n=80(size)，n=6(protein)］

＊＊P＜0.01 vs normal group;##P＜0.01 vs Iso;□P＜0.05 vs APS 0.1 mg·L－1;△P＜0.05 vs APS 1 mg·L－1

Group Cell size/μm3 Protein/μg(in 5 ×105cells Normal 1170 ±112 17.15 ±1.1 Iso 10 μmol·L －1 2204 ±167＊＊ 26.63 ±1.6＊＊KN93 0.2 μmol·L －1 1181 ±141 17.28 ±1.1 Iso+KN93 1208 ±139## 17.59 ±1.3##Iso+APS 0.1 mg·L －1 1597 ±189## 23.03 ±1.7##Iso+APS 1 mg·L －1 1428 ±144##□ 19.98 ±2.7##□Iso+APS 10 mg·L －1 1203 ±116##△ 17.39 ±1.5##△Iso+PRO 2 μmol·L －1 1218 ±156## 17.72 ±1.5##)

2.3 APS对心肌细胞外液中IL-6和TNF-α表达的影响 Tab 2显示，与正常对照组相比，Iso组心肌细胞外液中IL-6的含量增加了65.9%，且TNF-α含量的增加大于100%;KN93组细胞外液中IL-6和TNF-α的含量未见明显改变;与Iso组相比，Iso+KN93组、Iso+PRO组和黄芪多糖低、中、高剂量组中IL-6和TNF-α的含量均明显较少，且APS存在剂量依赖性;提示 APS可以减少炎症因子 IL-6和TNF-α的释放，保护心肌。

Tab 2 Effects of different treatments on expression of IL-6 and TNF-α in cultured myocardial cells induced by Iso(±s，n=6)

Tab 2 Effects of different treatments on expression of IL-6 and TNF-α in cultured myocardial cells induced by Iso(±s，n=6)

＊＊P＜0.01 vs normal group;##P＜0.01 vs Iso;□P＜0.05 vs APS 0.1 mg·L－1;△P ＜0.05 vs APS 1 mg·L－1

Group IL-6/ng·L－1 TNF-α/ng·L －1 Normal 131.2 ±1.9 22.8 ±2.9 Iso 10 μmol·L－1 217.7 ±6.8＊＊ 68.4 ±4.7＊＊KN93 0.2 μmol·L－1 138.4 ±2.8 25.3 ±2.3 Iso+KN93 141.7 ±1.8## 27.2 ±1.6##Iso+APS 0.1 mg·L －1 185.2 ±4.2## 36.4 ±3.3##Iso+APS 1 mg·L －1 163.7 ±4.7##□ 29.4 ±3.9##□Iso+APS 10 mg·L－1 140.0 ±2.4##△ 26.8 ±2.3##△Iso+PRO 2 μmol·L －1 143.9 ±3.2## 28.4 ±3.4##

2.4 APS对心肌细胞ANP mRNA表达的影响Tab 3和Fig 2显示，与正常对照组相比，Iso组心肌细胞ANP mRNA的表达明显增高了46.9%;KN93组ANP mRNA的表达未见明显改变;与Iso组相比，Iso+KN93组、Iso+PRO组和黄芪多糖低、中、高剂量组ANP mRNA的表达均降低，差异有统计学意义;表明KN93组、PRO组、黄芪多糖组均对Iso诱导的心肌细胞肥大有一定的抑制作用，提示阻断CaMKⅡ信号通路可能对心肌有保护的作用。

2.5 APS对心肌细胞CaMKⅡδ蛋白表达的影响

Tab 4和Fig 3显示，与正常对照组相比，Iso组CaMKⅡδ蛋白表达明显增高了;KN93组蛋白表达未见明显改变;与Iso组相比，Iso+KN93组、Iso+PRO组和黄芪多糖低、中、高剂量组CaMKⅡδ蛋白表达均明显降低，差异有统计学意义;提示黄芪多糖可能通过抑制CaMKⅡ信号通路的激活，从而达到保护心肌的作用。

Fig 2 Effects of different treatments on ANP mRNA expression of cultured neonatal rat cardiomyocytes

Tab 3 Effects of different treatments on ANP mRNA expression of cultured myocardial cells induced by Iso(±s，n=4)

Tab 3 Effects of different treatments on ANP mRNA expression of cultured myocardial cells induced by Iso(±s，n=4)

＊＊P＜0.01 vs normal group;##P＜0.01 vs Iso;□P＜0.05 vs APS 0.1 mg·L－1;△P ＜0.05 vs APS 1 mg·L－1

Group ANP mRNA(IA ANP/IA GAPDH)Normal 1.021 ±0.028 Iso 10 μmol·L－1 1.922 ±0.085＊＊KN93 0.2 μmol·L－1 1.029 ±0.017 Iso+KN93 1.141 ±0.038##Iso+APS 0.1 mg·L －1 1.406 ±0.159##Iso+APS 1 mg·L －1 1.211 ±0.097##□Iso+APS 10 mg·L－1 1.047 ±0.153##△Iso+PRO 2 μmol·L －1 1.351 ±0.172##

Tab 4 Effects of different treatments on CaMKⅡδ expression of cultured myocardial cells induced by Iso(±s，n=4)

Tab 4 Effects of different treatments on CaMKⅡδ expression of cultured myocardial cells induced by Iso(±s，n=4)

＊＊P＜0.01 vs normal group;##P＜0.01 vs Iso;□P＜0.05 vs APS 0.1 mg·L－1;△P ＜0.05 vs APS 1 mg·L－1

Group A CaMKⅡδ/A β-actin Normal 0.61 ±0.02 Iso 10 μmol·L－1 0.94 ±0.05＊＊KN93 0.2 μmol·L－1 0.63 ±0.01 Iso+KN93 0.65 ±0.02##Iso+APS 0.1 mg·L －1 0.81 ±0.06##Iso+APS 1 mg·L －1 0.72 ±0.08##□Iso+APS 10 mg·L－1 0.64 ±0.06##△Iso+PRO 2 μmol·L －1 0.67 ±0.05##

Fig 3 Effects of different treatments on CaMKⅡδ expression of cultured neonatal rat cardiomyocytes

3 讨论

心肌肥厚是心脏对各种病理性刺激产生的一种适应性生理反应。最初，可能是心脏为适应正常的室壁应力和保持收缩功能，但这种适应过程可能逐步发展为扩张型心肌病、心肌纤维化、心律失常、心力衰竭甚至猝死［8］。研究发现［9］，心肌肥厚过程中，肥厚基因的表达增高，且有炎症因子的过度表达。Serra等［10］研究发现，Iso诱导的心肌肥厚中TNF-α和IL-6的表达水平增高，运动疗法使促炎性因子明显减少，改善心肌收缩力，抑制左心室肥厚，防止心室重塑，保护心肌。因此，炎症在心肌肥厚中的作用是不能忽视的。

CaMKⅡ是一种普遍存在的、多效性的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在心脏中以 δ亚型为主［11］。CaMKⅡ通过与钙化的钙调蛋白(Ca2+/CaM)结合，使其抑制性结构域移位，发生自动磷酸化而被激活［12］。研究发现［13］，持续的心肌损伤通过激活CaMKⅡ信号通路，使促炎基因表达，产生炎症反应，进而发生心肌肥厚，因此，CaMKⅡ可以作为连接心肌肥厚和炎症信号通路的枢纽。实验表明，抑制CaMKⅡ的活性可以减少心肌肥厚、防止功能性重构及心律失常的发生［14］。Singh 等［15］发现，在野生型大鼠后壁心肌梗死模型中，CaMKⅡ被氧化激活，肥厚的标志性基因的表达上调，促炎基因如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、补体因子 B(Cfb)的含量明显增多，并且发生心肌细胞坏死和心肌纤维化。

本实验发现，经Iso处理的心肌细胞体积增大、总蛋白含量增多及ANP mRNA的表达增高，表明肥大模型成功;APS和CaMKⅡ阻断剂KN93均可明显减少上述表现，除此之外，均可使CaMKⅡδ蛋白的表达降低，且APS的剂量越大，效果越明显，呈现一定的剂量依赖性，提示阻断CaMKⅡ可降低ANP mRNA的表达，抑制心肌肥厚;同时APS可通过阻断CaMKⅡ有效抑制Iso诱导的心肌细胞肥大。实验还发现，经Iso处理的心肌细胞外液中IL-6和TNF-α的含量增加，APS和CaMKⅡ阻断剂KN93均可减少炎症因子IL-6和TNF-α的释放，APS在此亦呈剂量依赖性，提示APS通过阻断CaMKⅡ抑制炎症因子的产生。故APS可以通过阻断CaMKⅡ信号通路减少炎症因子的产生，抑制炎症反应和心肌细胞肥大，从而保护心肌。

众多研究表明，心肌肥厚的过程中涉及CaMKⅡ的激活和炎症反应，但APS是否可以通过减少炎症反应阻断CaMKⅡ达到保护心肌的作用，目前尚不清楚，本实验通过研究黄芪多糖对CaMKⅡ信号通路的影响，进一步深入研究心肌肥厚的可能机制和中国传统中药黄芪的保护作用，为心肌肥厚等心血管疾病的防治提供新思路。黄芪多糖抑制心肌肥厚的过程中，是否涉及其它通路及是否与CaMKⅡ信号通路存在交互作用有待于进一步的研究。

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