丁 岚， 田 英， 林国平， 陈志军， 张彩平， 王小鸥， 陈 浩， 龙石银△

(南华大学1生物化学与分子生物学教研室，2附属第一医院，湖南衡阳421001)

研究证实高密度脂蛋白 (high-density lipoprotein，HDL)具有抗动脉粥样硬化 (atherosclerosis，AS)的作用。HDL颗粒组成极不均一，利用双向电泳－免疫印迹法可将其分为preβ1-HDL、preβ2-HDL、HDL3c、HDL3b、HDL3a、HDL2a和 HDL2b7 个亚类［1］。HDL亚类组成及含量变化可能是导致心血管疾病发生的重要原因之一［2］。卵磷脂胆固醇酰基转移酶(lecithin cholesterol acyltransferase，LCAT)是人体血浆蛋白代谢的关键酶，对HDL的代谢具有十分重要的作用。当LCAT功能受损时，HDL成熟代谢受阻，AS发生率将增加［3］。本课题组前期研究发现CHD患者血浆HDL亚类有变小的趋势［4］，但机制未明。CHD患者LCAT水平与其血浆HDL亚类组成之间的关系尚未见报道。本研究通过分析CHD患者血浆HDL亚类组成与载脂蛋白、LCAT的关系，为进一步阐明CHD的发病机制及预示CHD的危险程度。

材料和方法

1 研究对象一般资料

选取在南华大学附属医院心内科行冠状动脉造影阳性，并根据1979年WHO的标准诊断为冠心病的患者144例 (男85例，女59例)，包括缺血性心肌病48例，急性冠脉综合征39例，心绞痛57例。对照组73例(男45例，女28例)为南华大学附属医院门诊健康体检的人群，经病史询问无冠心病、体格检查无阳性体征，排除了患有心、肺、肝、肾、内分泌及与脂代谢相关的疾病的人群。2组受试者之间年龄、性别比、既往病史及吸烟、饮酒情况无统计学意义。

2 血浆样品

受试者空腹12～14 h，取血，分离血浆，并将血浆样品分为2份，1份用于血脂及载脂蛋白含量的测定，另1份－80℃冻存，用于HDL亚类的检测。

3 血脂及载脂蛋白含量的测定

血浆甘油三酯 (triglyceride，TG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白胆固醇 (highdensity lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇 (low-density lipoprotein cholesterol，LDLC)、载脂蛋白 (apolipoprotein，apo)A-I和 apoB-100含量均由南华附属医院采用全自动生化分析仪 (O-lympus AU400)进行测定。LCAT血浆浓度采用酶联免疫吸附法 (enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)测定，试剂为武汉华美生物工程有限公司提供。

4 HDL亚类免疫印迹试验

用人血清HDL亚类免疫印迹检测法［1］进行测定，将样品中apoA-I的含量和所测得的HDL各亚类的相对百分含量相乘计算各亚类的含量(mg/L)。

5 统计学处理

采用SPSS 13．0软件进行统计学处理，数据用均数±标准差(mean±SD)表示，两个变量间的相关关系用直线相关分析，多元线性回归分析选入标准定为α=0．05，回归方程的显著性检验采用方差分析。以P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1 冠心病患者血浆HDL亚类含量

由图1可见，与正常受试者比较，冠心病患者小颗粒的 preβ1-HDL、HDL3b和 HDL3c斑点印迹显著增大，而大颗粒的HDL2a、HDL2b斑点印迹显著变小。

Figure 1．Electrophoretic comparisons of apoA-I-containing HDL subclasses．HDL subclasses were separated by nondenaturing 2-dimensional gel electrophoresis and immunodetection with a rabbit antihuman apoA-I-IgG labeled with horseradish peroxidase．A:CHD patients;B:normal subjects．图1 正常受试者与冠心病患者血浆HDL亚类双向电泳-免疫印迹实验结果对比

2 不同LCAT水平冠心病患者血脂及载脂蛋白含量的变化

冠心病患者按血浆LCAT浓度进行四分位数(19.22、36．39 和 55．32 mg/L)分层:Q1:LCAT ＜19.22mg/L;Q2:19．22≤LCAT ＜ 36．39mg/L;Q3:36．39≤LCAT ＜55．32mg/L;Q4:LCAT≥55．32mg/L。

随着LCAT浓度的降低，冠心病患者血浆TC、TG水平、apoB-100/A-I比值呈增加趋势，与最高四分位数组(Q4)相比，第二四分位数组(Q2)和最低四分位数组(Q1)TC、TG水平、apoB-100/A1比值均显著增加 (P＜0．05或 P＜0．01);与此相反，血浆HDL-C和apoA-I水平呈减少趋势，与最高四分位数组(Q4)相比，第三四分位数组(Q3)、第二四分位数组(Q2)和最低四分位数组(Q1)中HDL-C和apoA-I水平显著降低(P＜0．05或P＜0．01)。与对照组相比，CHD患者(总计)和LCAT各亚组血浆 TC、TG、LDL-C、apoB-100水平和 apoB-100/A-I比值显著增高，HDL-C和apoA-I水平显著降低 (P＜0．05或 P＜0．01)。以上结果提示冠心病患者血浆LCAT浓度降低与脂质代谢紊乱关系密切。

表1 冠心病患者按LCAT水平分层的血脂及载脂蛋白含量Table1．PlasmalevelsoflipidsandapolipoproteinsaccordingtoLCATlevelinCHDsubjects(Mean±SD)

3 不同LCAT水平冠心病患者血浆HDL亚类含量的变化

与最高四分位数组(Q4)相比，第三四分位数组(Q3)、第二四分位数组(Q2)和最低四分位数组(Q1)中 preβ1-HDL 含量增加，HDL2a和 HDL2b含量减少(P＜0．05或 P ＜0．01)，见表2。提示随着 LCAT浓度的降低，HDL颗粒大小有变小趋势，HDL成熟代谢受阻。与对照组相比，CHD患者(总计)和不同LCAT各组血浆小颗粒的preβ1-HDL、HDL3c和HDL3b水平显著增加，而大颗粒的HDL2a和HDL2b水平显著减少(P＜0．01)，表明CHD患者血浆HDL颗粒具有明显变小的趋势。

表2 冠心病患者按LCAT水平分层的血浆HDL亚类含量Table2．PlasmalevelsofplasmaHDLsubclassesaccordingtoLCATlevelinCHDsubjects(Mean±SD)

4 正常TC和高TC的冠心病患者血脂及载脂蛋白含量的变化

冠心病患者按血浆TC浓度进行分组:正常TC组≤5．17mmol/L，高 TC 组 ＞5．17mmol/L。与正常TC组相比，高 TC组的 TC、TG、LDL-C、apoB-100含量和apoB-100/A-I比值显著升高，HDL-C和apoA-I和LCAT含量显著降低 (P＜0．05或P＜0．01)，见表3。

表3 正常TC和高TC的冠心病患者血脂及载脂蛋白含量的变化Table 3．Plasma levels of lipids and apolipoproteins between normal TCand high TCgroups in CHD subjects(Mean±SD)

5 正常TC和高TC的冠心病患者血浆HDL亚类含量的变化

与正常TC组相比，高TC组preβ1－HDL含量显著增加，HDL2a和 HDL2b含量显著减少 (P＜0.01)，见图2。

6 冠心病患者血浆HDL亚类与血脂及其它参数的相关性分析

在控制性别、年龄下，相关性分析发现，LCAT和HDL-C含量与小颗粒的preβ1-HDL呈显著负相关(相关系数r值分别为 －0．446和 －0．317，P ＜0.01)，而与大颗粒HDL2a和HDL2b呈显著正相关(相关系数 r值分别为 0．512 和 0．519，0．248 和0.168，P＜0.05或 P＜0.01)。TC和 TG含量与preβ1－HDL呈正相关 (相关系数r值分别为0.388和0.242，P＜0.01)，TG含量与 HDL2b呈显著负相关 (r= －0.198，P＜0.05)。LDL-C含量与HDL3b呈正相关(r=0.168，P ＜0.05)，apoB-100含量与HDL2b呈负相关(r= －0.190，P ＜0.05)。ApoA-I含量与 HDL各亚类呈正相关，apoB-100/A-I比值与HDL各亚类呈负相关(均P＜0.01)，见表4。

Figure 2．The concentrations of plasma HDL subclasses between normal TCand high TCgroups in CHD subjects．Mean±SD．＊＊P ＜0．01 vs normal TC group．图2 正常TC和高TC的冠心病患者血浆HDL亚类含量

表4 冠心病患者血浆HDL亚类与血脂等参数的相关性分析Table 4．Correlation coefficients between the levles of plasma HDL subclasses and biochemical parameters in CHD subjects

7 冠心病患者血浆HDL亚类与血脂和载脂蛋白的多元线性回归分析

将HDL 7个亚类分别定义为因变量 (Y)，TC、TG、HDL-C、LDL-C、apoA-I、apoB-100 和 LCAT 定义为自变量(X)，进行多元线性回归分析。7个回归方程的显著性检验P值均小于0．01，线性关系显著。ApoA-I与7个 HDL亚类均呈显著正相关(P＜0.01)，TC 与preβ1-HDL呈显著正相关 (P ＜0．01)。LCAT 与 preβ1-HDL、HDL3c和 HDL3a呈显著负相关(P ＜0．05 或 P ＜0．01)，与 HDL2a和 HDL2b呈显著正相关(P＜0．01)，见表5。结合直线相关和多元线性回归分析表明，LCAT对血浆HDL亚类含量改变有较大的影响。

表5 冠心病患者血浆HDL亚类与血脂等参数的多元线性回归分析Table 5．Multiple linear regression analysis among the levels of plasma HDL subclasses and biochemical parameters in CHD subjects

讨 论

CHD是当今世界成人发病和死亡的主要原因，其死亡率在各种疾病中占首位［5］。HDL被认为是一种抗AS的血浆脂蛋白，可通过多种途径发挥抗AS的作用，其中最主要的作用是通过胆固醇的逆向转运［6-7］。近年一些研究表明HDL亚类分布异常可能直接影响 AS的发生、发展［8］。

CHD患者血浆HDL亚类含量结果显示，CHD患者小颗粒的 preβ1-HDL、HDL3c和 HDL3b浓度显著增加，而大颗粒的HDL2a和HDL2b浓度显著减少，提示CHD患者HDL颗粒有变小趋势，HDL成熟代谢过程可能受阻。此结果与已报道的2型糖尿病患者［9］、脑卒中患者［10］、Ⅳ型高脂血症患者［11］和肥胖患者［12］血清HDL亚类的变化趋势基本一致。这样的变化可能与血浆中调节脂质代谢的酶有关。本文对LCAT浓度分析中发现，冠心病患者LCAT浓度明显低于对照组，且与 preβ1-HDL含量呈负相关，与HDL2a、HDL2b含量呈正相关 (P ＜0．01)。LCAT 主要是催化HDL的游离胆固醇酯化从而使HDL经preβ1-HDL→HDL3→HDL2的过程逐渐成熟，apoA-I是LCAT的激活剂，研究中发现apoA-I水平减少，会使得LCAT的活性降低，HDL的成熟受到影响，出现小颗粒的 preβ1-HDL增多而大颗粒的 HDL2a和HDL2b减小的现象［13］。

将CHD患者按照LCAT水平四分位数分组后结果显示，随着LCAT水平降低，preβ1-HDL含量逐渐升高，HDL2a和HDL2b含量逐渐降低;apoA-I含量也随LCAT水平降低显著减少，其含量显著低于对照组。当apoA-I水平减少，LCAT在血浆中与apoA-I结合能力降低，催化HDL的游离胆固醇转变成胆固醇酯，小颗粒的HDL3转化为大颗粒的HDL2过程受阻。Sethi等［14］研究发现缺血性冠心病患者 LCAT与preβ1-HDL水平有显著负相关，并认为preβ1-HDL血浆浓度增加和LCAT活性降低是缺血性心脏病的一个很强的独立于HDL-C的正相关危险标志。大量研究发现LCAT水平与HDL-C呈正相关，与TG呈负相关，并认为LCAT活性和浓度的改变都将影响HDL 的成熟代谢过程［15］。

对于正常TC和高TC的CHD患者，其HDL亚类的分布特点均是小颗粒HDL亚类明显增多，而大颗粒HDL亚类明显减少，表明preβ1-HDL→HDL3→HDL2的成熟代谢过程受阻，这就必将造成HDL胆固醇逆向转运作用的减弱，血管内皮细胞过剩胆固醇堆积，加速泡沫细胞的形成，最终导致AS性心血管疾病的发病风险增大。高TC与正常TC受试者比较，preβ1-HDL 含量显著增加，HDL2a和 HDL2b含量显著减少，且LCAT浓度也明显减少。这表明血浆TC的升高和LCAT的降低共同加重HDL亚类成熟代谢障碍。

对冠心病来说，低水平的HDL-C是一个重要的危险因素，近年来把通过改变LCAT活性和浓度，而升高HDL-C作为减少CHD的重要途径之一。Chen等［16］用小分子化合物激活小鼠和仓鼠血浆中LCAT活性，发现给药组与对照组相比，血浆HDL-C和apoA-I浓度，HDL颗粒大小，胆固醇酯/游离胆固醇明显增加，而VLDL和HDL中TG有减少的趋势。并认为通过药物调节LCAT活性或水平，可以治疗血脂异常和减少动脉粥样硬化的发生。本研究发现，随着LCAT水平的降低，CHD患者血浆HDL颗粒变小的趋势更加明显;线性相关与多元回归分析结果提示:CHD患者HDL亚类代谢异常，不仅与较低水平的血浆LCAT有关，也与血脂改变有关，从而共同导致CHD的发生发展。因此对CHD患者的防治措施要从血脂、LCAT等多角度进行，改善或促进胆固醇逆向转运过程，调整血浆HDL亚类的组成。