齐育英 林振忠 明德松

(福建医科大学附属宁德市医院检验科，宁德352100)

乙型病毒性肝炎是我国常见的慢性传染病之一，严重危害人民健康。人体感染乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)后临床转归差异大，细胞因子在其中的作用越来越受到重视。HBV感染人体后，免疫细胞分泌大量的细胞因子，可导致病毒清除或持续感染甚至肝脏损伤的不同结果，在这些因子中IL-6、IL-10、IL-17分别代表不同亚群特点和作用，在免疫调节反应中具有重要意义。本研究通过比较慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B，CHB)患者血清中这3种因子的表达情况，以探讨其在CHB发病机制中的作用及意义。

1 对象与方法

1.1 对象 选择2010年7月～2011年8月在福建医科大学附属宁德医院和福建医科大学附属泉州第一医院住院的CHB患者70例，其中男性54例，女性16例，年龄20～58岁，平均 (30.65±14.26)岁;非重度组46例，重度组24例;HBeAg阳性41例，阴性29例。所有患者诊断均符合病毒性肝炎防治方案和慢性乙型肝炎防治指南［1，2］。全部患者至少3个月内未接受过免疫调节剂(如胸腺肽、糖皮质激素)、保肝及抗病毒治疗，排除重叠甲、丙、丁、戊型肝炎病毒、人体免疫缺陷病毒等病毒感染以及有已知遗传或代谢性肝病、胆汁淤积性肝病、肥胖或自身免疫性肝病、原发性肝癌等患者。另选同一时期来泉州市第一医院门诊健康体检者20例为正常对照组，其中，男性13例，女性7例，年龄21～62岁，平均(36.50 ±13.26)岁。

1.2 方法

1.2.1 标本 采集70例CHB患者和20名健康体检者清晨空腹外周静脉血5 ml，3 000 r/min离心3分钟后，分离血清储存于－80℃待ELISA检测。

1.2.2 血清细胞因子检测 取上述冻存的血清标本，室温冻融后，采用美国MAPKET公司酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒检测血清中IL-6、IL-10、IL-17表达水平，操作严格按照试剂盒提供的说明书进行，在酶标仪 (Alisei Quality System，意大利 SEAC公司)450 nm处读取数据。

1.2.3 其他指标检测 采用美国雅培公司试剂检测乙型肝炎病毒标志物(HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc)。血清 HBV-DNA定量采用PE9700实时定量荧光检测仪 (美国PE公司)和血清HBV-DNA试剂盒(中山医科大学达安基因股份有限公司)。采用全自动酶免分析生化仪(LX-20，美国 Beckman公司)检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBIL)、直接胆红素 (DBIL)等生化指标。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0统计分析软件进行统计分析，实验结果以±s表示，各组间结果采用Mann-Whitney U检验，采用Spearman’s检验进行相关性检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象一般临床资料比较 CHB组与健康对照组在年龄、性别构成比等方面差异均无统计学意义，各组间具有可比性(P＞0.05)，非重度 CHB组和重度CHB组患者较对照组ALT、AST均明显升高(P＜0.05)，重度CHB组TBIL较对照组明显升高(P＜0.05)，重度 CHB组 ALT、AST及 TBIL较非重度组明显升高(P＜0.05)，结果见表1。

表1 各组研究对象基本信息(±s)Tab.1 Basic data of each group(±s)

表1 各组研究对象基本信息(±s)Tab.1 Basic data of each group(±s)

Note:1)P ＜0.05，vs health control;2)P ＜0.05，vs CHB non-severe;3)P ＜0.05，vs health control.

n Groups Male Female Age(year)Liver function ALT(U/L) AST(U/L) TBIL(μmol/L)CHB non-severe 35 11 34.61 ±10.89 332.11 ±309.461) 171.03 ±165.071).35 ±1.12 19.00 ±4.75 21.24 ±11.6 CHB severe 19 5 30.29 ±8.64 816.06 ±839.611)3) 457.48 ±446.731)3) 158.53 ±116.962)3)Health control 14 6 36.5 ±13.26 16.4 ±1.91 13

2.2 各组外周血细胞因子含量比较 与健康对照组相比较，各组CHB患者IL-6、IL-10、IL-17均明显升高(P＜0.05)，结果见表2。根据HBeAg是否阳性，将70例CHB患者分为e抗原阳性和e抗原阴性2组，比较2组间3种细胞因子的水平，HBeAg阳性组IL-6水平低于阴性组，但差异无统计学意义(P=0.104);HBeAg阳性组 IL-10水平高于阴性组，但差异亦无统计学意义(P=0.104);而IL-17水平高于e抗原阴性组(P＜0.05)，结果见图1。根据HBV-DNA滴度的高低，将70例 CHB患者分为HBV-DNA≥105拷贝/ml和 ＜105拷贝/ml两组，比较2组间3种细胞因子的差异，结果3种细胞因子均无显著性差异(P＞0.05)，结果见图2。

2.3 CHB患者中3种细胞因子与ALT、AST、TBIL及HBV-DNA的相关性分析 结果显示，IL-6与AST、TBIL、HBV-DNA均呈正相关关系(r分别为0.416、0.374、0.317，P 值均小于 0.05);IL-10 与AST、TBIL、HBV-DNA无明显相关关系(r分别为0.113、－0.025、－0.12，P 值分别为 0.353、0.837、0.33)。IL-17 与 AST、TBIL、HBV-DNA 无明显相关关系(r分别为 －0.084、0.012、0.135，P 值分别为0.489、0.921、0.272)。

图1 3种细胞因子在HBeAg阳性、阴性两组血清中的含量比较Fig.1 Level of 3 cytokines in serum of HBeAg positive group and HBeAg negative group

图2 3种细胞因子在HBV-DNA≥105拷贝/ml、＜105拷贝/ml两组血清中的含量比较Fig.2 Level of 3 cytokines in serum of HBV-DNA≥105copies/ml and ＜105copies/ml group

表2 各组对象血清中3种细胞因子表达情况(±s)Tab.2 Level of 3 cytokine in serum of each group(±s)

表2 各组对象血清中3种细胞因子表达情况(±s)Tab.2 Level of 3 cytokine in serum of each group(±s)

Note:1)P ＜0.05，vs CHB non-severe and severe;2)P ＜0.05，vs CHB non-severe.

IL-6 IL-10 IL-17 Groups n CHB non-severe 46 4.83 ±6.23 95.73 ±107.97 125.95 ±43.19 CHB severe 24 11.32 ±20.372)69.52 ±66.49 137.38 ±54.56 Health control 20 2.78 ±2.001)26.74 ±19.211)91.42 ±35.481)

3 讨论

乙型肝炎是一种免疫相关疾病，HBV感染人体后对肝细胞无明显的损伤作用，而是通过诱发机体的免疫反应间接损伤肝细胞，同时，机体产生的免疫反应又发挥着清除病毒的作用［3］。HBV感染的转归主要取决于病毒和机体免疫应答2个方面，机体免疫功能紊乱，尤其是T淋巴细胞亚群与其细胞因子的失调与慢性肝病的发生、发展密切相关［4，5］。外周成熟的T淋巴细胞无论在表型上还是功能上都是异质性群体，按其表型不同可分为CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞，按其功能不同则可分为辅助性T淋巴细胞(helper T lymphocyte，Th)、抑制性T淋巴细胞(suppressor T lymphocyte，Ts)和细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)。目前认为，幼稚CD4+T淋巴细胞在不同细胞因子作用下可以分化为 Th1、Th2、Th17和调节性T淋巴细胞(regulatory T lymphocyte，Treg)4个主要的功能成熟的亚群，分别通过不同的转录途径和特征性的细胞因子执行不同的生物学功能，形成一个巨大的细胞因子网络体系［6］。一种细胞因子往往有多种生物活性，而多种细胞因子又可有共同的生物活性，不同的细胞因子之间形成网络，相互调节产生和发挥效应，而这些细胞因子的调节失调与慢性肝病的发生、发展密切相关。其中，Th1主要产生 IL-2、IL-12、TNF-β、IL-18、干扰素-γ(IFN-γ)等，介导细胞免疫应答;Th2 主要产生 IL-4、IL-5、IL-10、IL-14 等，介导体液免疫应答;Th17以表达IL-17A为特征，同时也分泌 IL-17F、IL-22、IL-21、IL-6 等因子，是 HBV 感染的主要致炎细胞亚群;Treg细胞通过细胞-细胞直接接触及释放IL-10和TGF-β等抑制因子，维持自身免疫耐受［7-10］。在这些因子中 IL-6、IL-10、IL-17 分别代表了不同亚群特点和作用，在免疫调节反应中具有重要意义。

IL-6为体内重要的致炎性细胞因子，可以调节许多急性期反应蛋白的合成，同时也是一种与慢性肝病患者免疫调节有关的因子［11］，在急、慢性肝损伤早期即呈高水平表达。正常人外周血清中IL-6的浓度很低，往往低于5 kU/L［12］，其在大多数正常静息细胞中并不表达，但在感染或其他因素刺激下，T淋巴细胞和单核巨噬细胞被激活，导致 IL-6合成和释放增加，反过来促进激活的T细胞增殖，刺激未成熟的胸腺细胞分化为成熟的CTL，从而清除细胞内病毒，但同时增强了肝脏的炎症反应，从而加重肝细胞的损伤［13］。研究发现血清 IL-6在肝炎、肝硬化性肝炎的急性期显著高于正常人群，且在病情严重或死亡者升高更明显，并与白细胞和中性粒细胞数量、C反应蛋白(CRP)和TBIL水平正相关，与血清总蛋白水平负相关，认为 IL-6的升高与 CHB的严重度相关［14］。本研究发现，对于CHB患者，重度组IL-6水平较非重度组及健康对照组明显升高，IL-6与AST、TBIL均呈正相关关系，血清AST、TBIL水平是反映肝脏功能的常用指标，说明血清IL-6水平与肝细胞坏死程度密切相关。通过对IL-6与HBV-DNA进行相关性研究，发现IL-6与HBV-DNA呈正相关，可能为HBV DNA载量增加可进一步导致乙肝患者细胞免疫功能紊乱加重，从而产生和释放IL-6，促进炎性反应。有报道认为，通过抗HBV治疗后，降低病毒载量，进而降低IL-6，对肝细胞功能恢复有一定的促进作用［15］，进一步说明血清IL-6水平与肝细胞坏死程度密切相关。

IL-10为体内重要的抗炎性细胞因子，通过抑制Th1细胞的增殖和IL-2、IFN、白三烯等细胞因子的产生从而抑制Th1型免疫应答［16］，降低患者的细胞免疫功能，促进Treg的增殖和活化，从而有利于诱导机体对外来病原的耐受，导致乙肝病毒持续存在［17］。本研究显示，CHB各组患者血清IL-10水平较对照组明显升高，差异有统计学意义，非重度组IL-10高于重度组，提示优势Th2型细胞因子IL-10抑制Th1细胞应答，使机体不能有效清除受病毒感染的肝细胞，造成HBV感染的持续，而随着炎症的加重，IL-10呈下降的趋势。本研究同时发现不同的e抗原情况2组IL-10水平差别无统计学意义，可能与2组间HBV-DNA水平无显著性差异有关。赖娅芳等［18］的研究发现，血清中HBV-DNA定量与IL-10水平高度正相关，提示IL-10水平升高可以抑制宿主抗HBV细胞免疫活性，导致HBV在体内的持续复制与表达，是乙肝病毒感染慢性化的主要原因。但本研究按HBV-DNA载量高低进行分组，发现2组的IL-10水平差异无统计学意义，可能是由于外周血的检测反映的是循环中的总效应和总水平，并不反映炎症局部的细胞因子表达情况［19］。

IL-17主要是由活化的记忆性CD4+T淋巴细胞(即Th17细胞)分泌的特异性的促炎症效应因子［20］，可以促进机体局部产生趋化因子如IL-8、IL-6等，使单核细胞及中性粒细胞迅速增长，增强局部炎症，诱导其致炎因子引起组织损害。有研究发现大部分的CHB患者的血清和肝组织IL-17与HBVDNA、ALT水平呈正相关［8］。本研究发现，CHB 患者各组IL-17水平均较对照组明显升高，差异有统计学意义，提示IL-17与肝脏炎症关系密切，但相关性分析并未发现其与肝脏炎症水平呈正相关，因此，IL-17可能参与了HBV诱导的肝脏的病理损伤，但是否参与了清除病毒的T细胞免疫，目前尚不明确，需要进一步的研究。同时，本研究按HBV-DNA水平高低进行分组，发现2组间的IL-17水平差异无统计学意义，进一步行相关性分析，亦未发现IL-17与HBV-DNA水平呈正相关关系，可能因为IL-17介导的肝细胞炎性损伤并没有在乙肝患者长期慢性感染中起主要作用。

本研究通过比较CHB患者血清中IL-6、IL-10、IL-17的表达情况，初步阐明了这3种细胞因子在HBV感染慢性化中的作用及意义，为针对HBV的免疫治疗提供细胞因子方面的理论依据和新的思路。

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