陈育民 陈晓洁 刘晓霞 王雪玲 陈雪皎 (河北工程大学医学院，邯郸056029)

恶性肿瘤是危害人类健康和生命的严重疾病之一。目前，化学治疗是肿瘤治疗中必不可少的手段之一，但单纯化疗常引起免疫抑制，导致恶性反复感染，机体衰弱，时常出现各种不同程度的毒副反应、预后不良而加速患者的死亡。环磷酰胺(CTX)作为临床常用的化疗药物，对免疫系统有抑制作用，T细胞也在被抑制之列，而T细胞介导的细胞免疫是抗肿瘤的主力[1]，故化疗后肿瘤患者的抗肿瘤能力降低，无法自我彻底清除体内残存的肿瘤细胞，使其应用受到一定的限制。因此，寻找能够逆转化疗对T细胞抑制的药物，将有助于临床上更好开展化疗治疗肿瘤。

八珍汤源自《正体类要》，是四君子汤和四物汤的复方。四君子汤能健脾益气，四物汤可补血养血，八珍汤能汇两方之功，奏两方之效，为气血双补的经典方。临床上常用于内科、妇科上的病后失调、久病失治、失血过多等慢性消耗性疾病的治疗。近年来，中药日益受到重视，八珍汤作为中国古方的经典方，其对免疫系统的药理作用近年来已有报道，但对化疗后荷瘤小鼠T细胞亚群和细胞因子的影响还未见报道。故本研究探讨了八珍汤对化疗后荷瘤小鼠T细胞增殖、T细胞亚群及细胞因子的影响，为临床上辅助治疗肿瘤提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物及瘤株 健康昆明小鼠，雌雄各半，体重18～22 g，由河北工程大学实验动物中心提供。S180肿瘤细胞由河北医科大学第四医院科研中心馈赠。

1.1.2 药物 八珍汤(一副)包括:当归10 g，川芎5 g，白芍 8 g，甘草 5 g，熟地黄 15 g，人参 3 g，白术10 g，茯苓8 g。均购自邯郸市中医院中药房，经河北工程大学医学院药理室鉴定。将所有药材水中浸泡0.5小时，加入大约为药材体积10倍的水，煮沸1小时，滤出药液;再加5倍体积的水，煮沸0.5小时，滤出药液。两次药液合并，水浴蒸发至终浓度为2 g生药/ml的药液。4℃保存备用。

1.1.3 试剂 四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、RPMI1640培养基、ConA为美国Sigma公司产品;PE-Cy7-抗小鼠 CD3、FITC-抗小鼠 CD4、PE-抗小鼠CD8均为eBioscience公司产品;小鼠IL-2、IFN-γ ELISA试剂盒为伊莱瑞特生物科技有限公司产品;胎牛血清为杭州四季青生物材料有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立、分组及给药 取腹腔内传代7天的肉瘤S180小鼠，脱臼处死小鼠，在无菌条件下抽取腹腔内瘤细胞，并以生理盐水洗涤3次，2 500 r/min离心3分钟，弃上清液，用无菌生理盐水调整肿瘤细胞浓度为5×106ml-1，接种于小鼠右腋窝皮下(0.2 ml/只)。接种24小时后随机分为3组，每组10只，分别为模型组、CTX组、八珍汤+CTX组。另取10只正常小鼠作为正常对照组。正常对照组和模型组腹腔注射生理盐水0.1 ml/(10 g·d)，连续3天，CTX组和八珍汤+CTX组腹腔注射环磷酰胺(CTX)0.1 ml/(10 g·d)，连续3天。自第4天始，正常对照组、模型组和CTX组用生理盐水0.2 ml/(10 g·d)灌胃，八珍汤+CTX组用八珍汤0.2 ml/(10 g·d)灌胃，连续10天。末次给药后2小时进行指标检测。

1.2.2 MTT法检测八珍汤对化疗后荷瘤小鼠T细胞增殖的影响 处死小鼠，无菌取脾，制备脾细胞悬液，台盼蓝计数活细胞在95%以上。用完全RPMI1640培养液将脾细胞悬液调配成细胞浓度2×106ml-1的单细胞悬液。取已制备的脾细胞悬液加入96孔培养板中，100 μl/孔，每个样本做6个孔。其中3孔加ConA液(0.1 mg/ml)100 μl，使其终浓度为5 μg/ml，另3孔作为对照。置 37℃、5%CO2培养箱中培养72小时。于实验终止前每孔加入5 g/L MTT 20 μl，振荡器上振荡10分钟，继续培养4小时。培养结束后，每孔加入100 μl DMSO，振荡10分钟，使紫色结晶完全溶解。用酶标仪于570 nm波长测定A值。细胞增殖率=(实验组平均A值 /对照组平均A值)×100%。

1.2.3 流式细胞术检测八珍汤对化疗后荷瘤小鼠T细胞亚群的影响 取100 μl已制备的脾淋巴细胞悬液于EP管中，4℃、1 500 r/min离心5分钟，加入冷 PBS 1 ml，离心，弃上清，加冷冻 PBS 100 μl，并按说明加入 PE-Cy7-抗小鼠 CD3、FITC-抗小鼠 CD4、PE-抗小鼠 CD8，4℃避光孵育30分钟，加入 PBS1 ml，离心，弃上清，加入 500 μl PBS，流式细胞仪检测。

1.2.4 ELISA检测八珍汤对化疗后荷瘤小鼠血清IFN-γ、IL-2的影响 末次给药后2小时，各组小鼠球后静脉丛采血，每只取血0.8～1 ml，分离血清，并严格按照试剂盒说明进行操作。实验组均设3个复孔。将每个标准品及标本的OD值减去空白孔的OD值，绘制标准曲线，以标准品浓度作为横坐标，OD值为纵坐标，以平滑曲线连接各标准品的坐标点，通过标本的OD值在曲线上查出其对应浓度。IL-2/IFN-γ(μg/L)=标准曲线上查出的浓度×稀释倍数。

1.3 统计学分析 应用SPSS11.5软件对所有数据进行统计学处理，结果以±s表示，两组间均数比较用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 八珍汤对化疗后荷瘤小鼠T细胞增殖的影响

用MTT法检测各组T细胞经ConA刺激72小时后的增殖能力，由图1可见各组荷瘤小鼠的T细胞增殖能力显著低于正常对照组(P＜0.01)，CTX组T细胞增殖能力明显低于模型组(P＜0.01)，八珍汤+CTX组T细胞增殖能力明显高于CTX组(P＜0.01)，与模型组相比没有显著性差异，但有增高趋势(P＞0.05)。

表1 八珍汤对化疗后荷瘤小鼠T细胞亚群的影响(±s，%)Tab．1 Effect of bazhen decoction on subpopulations of T lymphocytes in tumor-bearing mice after chemotherapy(±s，%)

表1 八珍汤对化疗后荷瘤小鼠T细胞亚群的影响(±s，%)Tab．1 Effect of bazhen decoction on subpopulations of T lymphocytes in tumor-bearing mice after chemotherapy(±s，%)

Note:Compared with normal control group，1)P ＜0.01;compared with model group，2)P ＜0.01;compared with model group，3)P ＜0.05;compared with CTX group，4)P ＜0.01.

7±4.29 1.59±5.06 Model 10 40.21±4.711) 23.89±6.321) 12.51±3.651) 1.82±3.271)CTX 10 24.26±7.281)2) 15.60±4.931)2) 7.46±3.011)2) 1.92±2.351)Bazhen decoction+CTX 10 34.93±4.241)3)4) 19.46±5.041)3)4) 10.48±4.841)3)4) 1.79±4.831)CD4/CD8 Normal control 10 47.43±7.08 28.25±3.12 17.1 Groups n CD3+T CD3+CD4+T CD3+CD8+T

图1 八珍汤对化疗后荷瘤小鼠T细胞增殖能力的影响Fig．1 Effect of Bazhen decottion on proliferation of T lymphocytes in tumor-bearing mice after chemotherapy

2.2 八珍汤对化疗后荷瘤小鼠T细胞亚群的影响由表1可见，各荷瘤小鼠组的T细胞亚群明显低于正常对照组(P＜0.01)，而CD4/CD8比值明显高于正常对照组(P＜0.01)。CTX组的T细胞亚群与模型组相比显著降低(P＜0.01)。八珍汤+CTX组的T细胞亚群明显高于CTX组(P＜0.01)，但仍低于模型组(P＜0.05)。各荷瘤小鼠组CD4/CD8比值均无显著性差异(P＞0.05)。

2.3 八珍汤对化疗后荷瘤小鼠血清IFN-γ、IL-2的影响 ELISA测得各组小鼠血清细胞因子的结果如表2所示:各荷瘤小鼠组血清中IFN-γ、IL-2的含量明显低于正常对照组(P＜0.01)，CTX组荷瘤小鼠血清中 IFN-γ、IL-2含量明显低于模型组(P＜0.01)，八珍汤+CTX组小鼠血清IFN-γ、IL-2含量明显高于CTX组(P＜0.01)，而与模型组无显著性差异(P＞0.05)。

表2 八珍汤对化疗后荷瘤小鼠血清IFN-γ、IL-2的影响(μg/L，±s)Tab．2 Effect of Bazhen decoction on serum levels of TFN-γ and IL-2 in tumor-bearing mice after chemotherapy(μg/L，±s)

表2 八珍汤对化疗后荷瘤小鼠血清IFN-γ、IL-2的影响(μg/L，±s)Tab．2 Effect of Bazhen decoction on serum levels of TFN-γ and IL-2 in tumor-bearing mice after chemotherapy(μg/L，±s)

Note:Compared with normal control group，1)P ＜0.01;compared with model group，2)P ＜0.01;compared with CTX group，3)P＜0.01.

Groups n IFN-γIL-2 Normal control 10 10.276±6.953 9.841±2.618 Model 10 7.702±7.0161) 6.914±3.9081)CTX 10 4.260±3.5621)2) 4.012 1±5.2831)2)Bazhen decoction+CTX 10 7.329±3.7081)3) 7.025±2.9671)3)

3 讨论

肿瘤是严重危害人类健康的疾病，目前除手术外，化学疗法是治疗肿瘤的主要手段，但它在杀灭肿瘤细胞的同时，也会杀伤正常细胞，对机体的免疫功能全面抑制，使机体免疫功能低下。而T细胞介导的细胞免疫功能低下在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。故机体T细胞的状况能够反映机体抗肿瘤的能力。因此如何提高化疗后机体T细胞功能是肿瘤治疗的一个重要内容。

国内已将中草药用于防治化疗毒副作用方面[2-4]。八珍汤源自《正体类要》，是四君子汤和四物汤的复方。四君子汤能健脾益气，四物汤可补血养血，八珍汤能汇两方之功，奏两方之效，为气血双补的经典方。临床上常用于内科、妇科上的病后失调、久病失治、失血过多等慢性消耗性疾病的治疗。本课题组之前的研究发现八珍汤能够解除TGF-β1对T细胞增殖和活化的抑制作用[5]。本文从下述指标观察了八珍汤对化疗后荷瘤小鼠T细胞及细胞因子的影响。

在体外研究中，T细胞经特异性抗原或非特异性抗原，如ConA等的诱导，会发生转化增殖。因此，常将T细胞的增殖反应作为评价T细胞功能，反映机体免疫状况的指标[6]。T细胞按表面CD分子的不同分为CD4+T细胞和CD8+T细胞，参与抗肿瘤免疫的主要是CD8+T细胞介导的细胞免疫，故T细胞亚群是反映机体抗肿瘤能力的一个常用指标。IFN-γ是活化的T细胞产生的一种具有多潜能的细胞因子，对免疫系统具有重要的调节作用，它可以激活巨噬细胞，促进MHC分子表达和抗原提呈，诱导Th1细胞分化，抑制Th2细胞分化，从而促进细胞免疫功能[7]。IL-2主要由活化的细胞产生，是调节机体免疫功能最主要的细胞因子之一。它能刺激T细胞的生长和分化，激活NK细胞和巨噬细胞，促进CTL细胞的功能。故IFN-γ和IL-2不仅能反映T细胞的功能，而且在一定程度上也能反映机体的免疫水平，在肿瘤治疗中发挥重要作用[8]。

本实验结果显示:八珍汤能够促进T细胞增殖，提高CD4+T细胞和CD8+T细胞比例，特别是CD8+T细胞比例，促进T细胞分泌IFN-γ和IL-2。故可知八珍汤可促进T细胞功能，提高机体细胞免疫能力。

因此，本研究为临床上将八珍汤用于改善化疗所致机体免疫功能低下提供了理论依据。但有关八珍汤的给药时间、用药时间长短等问题需要进一步探讨。

1 金伯泉.医学免疫学[M].第5版.北京:人民卫生出版社，2008;214-215.

2 胡志明，邱锡谦，曾玉芬.扶正排毒通肠汤治疗恶性肿瘤化疗毒副作用60例[J].江西中医药，2011;42(338):25-26.

3 古红莉.参麦注射液减轻恶性肿瘤化疗毒副作用60例临床观察[J].新中医，2008;40(10):20-21.

4 邵青伟，葛 熙.参芪扶正液预防癌症化疗所致毒副作用的观察与护理[J].实用临床医药杂志，2010;14(10):17-18.

5 刘晓霞，陈剑华，陈育民et al.八珍汤对TGF-β1抑制的T淋巴细胞增殖及其活化影响[J].细胞与分子免疫学杂志，2009;25(11):1053-1055.

6 吕世静.临床免疫学检验[M].第2版.北京:中国医药科技出版社，2010;165-166

7 金伯泉.医学免疫学[M].第5版.北京:人民卫生出版社，2008;60-61.

8 金伯泉.医学免疫学[M].第5版.北京:人民卫生出版社，2008;252-253.