王志旺 孙少伯 程小丽 王永辉 任 远 王瑞琼 蔺兴遥 李应东

(甘肃中医学院/甘肃省中药药理与毒理学重点实验室，兰州730000)

中药当归为伞形科植物，当归Angelica Sinensis(oliv.)Diels干燥根，有补血活血、调经止痛、润肠通便的功能，主治血虚萎黄、月经不调、肠燥便秘等症，自古一直被中医广泛用于多种疾病的治疗，素有“十方九归”之称。当归治疗哮喘自古就有记载，《神农本草经》、《本草纲目》、《本草图经》以及《慎斋医书》等著作中都有当归治疗哮喘的理论与临床应用，如《神农本草经》中记载当归“为补血活血要药，故主咳逆上气也”。实验研究发现当归挥发油对豚鼠离体痉挛状态气管平滑肌有明显的解痉作用[1]，本次研究以哮喘大鼠行为学、肺组织淋巴细胞T盒(T-bet)和GATA结合蛋白3(GATA-3)蛋白表达水平以及肺组织病理学等为研究指标，探讨当归挥发油对实验性哮喘大鼠的平喘作用，为当归以及当归挥发油的平喘、治疗支气管哮喘提供理论依据。现将实验结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 SD大鼠，雌性，体质量115～145 g，SPF级，由甘肃中医学院实验动物中心提供，实验动物生产许可证号SCXK(甘)2004-0006。甘肃中医学院实验动物中心饲养，普通饮食及饮水。超临界CO2萃取当归挥发油，甘肃省岷县康达药业开发有限责任公司提供;醋酸地塞米松片，批准文号:国药准字H33020822，浙江仙琚制药股份有限公司生产，产品批号:111068;卵清白蛋白(OVA)，Grade V，Sigma公司产品;吐温-80，上海大众制药厂，生产批号:70093;抗体T-bet、抗体GATA-3购于美国Santa Cruz公司。实验时，用0.8%吐温-80配制当归挥发油(1.6%、0.8%、0.4%)与地塞米松(0.005%)乳状液，另配制0.8%吐温-80的空白对照液，冷藏备用。420AI超声雾化器，江苏鱼跃医疗设备股份有限公司生产;TGL-16G高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂;722型分光光度计，上海第三分析仪器厂产品;BS1103型Sartorius电子分析天平，北京赛多利斯仪器有限公司;HH-S型恒温水浴锅，金坛市正基仪器有限公司。

1.2 动物筛选 将大鼠放于自制的密闭玻璃箱内，超声雾化0.5%磷酸组胺生理盐水溶液刺激大鼠，观察大鼠吸入组胺后的呼吸变化情况，选择吸入组胺后20秒内出现呼吸急促、前肢缩抬、点头或腹式呼吸等哮喘症状的大鼠作为实验用大鼠。

1.3 分组、造模与给药 取筛选合格雌性大鼠[2]54只，按体重分层随机分为6组，即正常对照组(Group A)、模型对照组(Group B)、地塞米松组(Group C)、当归挥发油高剂量组(Group D)、中剂量组(Group E)及低剂量组(Group F)，分笼饲养，自由进食去OVA的特殊饲料和水。致敏时，除正常对照组外，各组于第1天、第8天用新鲜配制的OVA 50 mg(5%)与含100 mg(10%)氢氧化铝凝胶的生理盐水混悬液共1 ml，在大鼠两后足跖、两侧腹股沟做皮下注射，每点0.2 ml，同时腹腔注射0.2 ml;正常对照组以生理盐水代替致敏。第15天开始激发，即将大鼠置于特制玻璃容器内(40 cm×30 cm×20 cm)，用超声雾化器以雾化量0.8 ml/min雾化吸入1%OVA的生理盐水，每次20分钟，1次/天，连续28天;正常对照组以生理盐水代替激发。激发前1小时，各组大鼠按10 ml/kg灌胃给药，即当归挥发油各剂量组 ig当归挥发油160、80、40 mg/kg，阳性对照组ig地塞米松0.5 mg/kg，正常对照组与模型对照组ig空白对照液;1次/天，连续28天。

1.4 指标观测与方法

1.4.1 支气管激发实验 分别于实验的第28天和第42天进行。用1%OVA激发液雾化吸入(雾化参数与激发相同)20分钟，观察15分钟内大鼠的反应并记录评分，评分原则参照相关文献进行[3，4]，记录大鼠打喷嚏次数、抓鼻次数与哮喘程度，观察药物的平喘作用。具体计分方法是:大鼠没有出现喷嚏计为0分，出现1～5个喷嚏计为1分，出现6～10个喷嚏计为2分，喷嚏＞11个计为3分;没有抓鼻计为0分;抓鼻1～5个计为1分，抓鼻6～10个计为2分，抓鼻＞11个计为3分;无喘息症状计为0分，有轻度喘息(躁动或静伏)计为3分，明显喘息(呼吸困难，腹式呼吸、呼吸急促呈点头状但幅度较小、迅速抬头做喘息状)计为6分，严重喘息(呼吸极度困难，呼吸急促呈点头状幅度大频率高、或反应迟钝)或致死计为9分。

1.4.2 Western blot测定肺组织中T-bet与GATA-3的蛋白表达水平 大鼠最后一次激发24小时后，股静脉采血处死，打开胸腔，于固定位置取未经灌洗的左肺组织100 mg，加入600 μl裂解液，经冰上匀浆、超声、静置后4℃离心(15 000 r/min)15分钟，取上清液用BCA法测定蛋白浓度。取50 μg蛋白并加入等体积的上样缓冲液(100 mmol/L三羟甲基氨基甲烷酸盐，pH值6.8，200 ml/L甘油，0.2 g/L溴酚蓝，20 g/L十二烷基硫酸钠，200 mmol/L二硫苏糖醇)，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并将蛋白转移至硝酸纤维膜上，分别与小鼠抗大鼠T-bet、GATA-3 mAb(1∶500)和辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG抗体(1∶1 000)室温孵育2小时，小鼠抗大鼠βactin mAb(1∶2 000)和辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG抗体(1∶4 000)同样室温温育2小时。应用发光试剂显示蛋白条带，将显色的X线片经图像分析系统处理，比较 T-bet、GATA-3与 β-actin的相对吸光度值，进行半定量分析。

1.4.3 肺组织病理变化 取大鼠未经灌洗的左肺组织，10%甲醛固定，石蜡切片，HE染色，参照文献[3，4]，在光学显微镜下对上皮细胞脱落程度与肺组织炎症细胞浸润程度进行观察和半定量分析。

2 结果

2.1 当归挥发油对哮喘大鼠造模过程中行为学的影响 见表1。

在哮喘模型复制过程中，选择实验第28天与第42天，在雾化吸入OVA激发过程中及激发后15分钟内，观测大鼠打喷嚏、抓鼻甚至哮喘样症状并计分。实验中发现，有哮喘样症状的大鼠打喷嚏与抓鼻反而不明显，故在文献的基础上对支气管激发实验中大鼠的行为计分方法进行了修正，细化了哮喘样症状的评分标准并加大哮喘评分分值。实验结果显示，模型对照组大鼠在支气管激发实验中的行为综合评分值显著增加，与正常对照组比较有统计学意义(P＜0.01);各给药组大鼠在激发实验中的行为综合评分值明显减小，特别是实验第42天，大鼠的行为综合评分显著减小(P＜0.01)。

2.2 当归挥发油对哮喘大鼠肺组织中T-bet和GATA-3蛋白表达水平的影响 见图1、表2。经Western blot法分析显示，在蛋白相对分子质量为62 000、50 000和45 000处有表达条带，分别是 T-bet、GATA-3与β-actin蛋白表达(图1)。经半定量分析可知，T-bet蛋白在哮喘模型对照组大鼠肺组织中低表达，经当归挥发油治疗后，其表达水平显著提高(P＜0.01);GATA-3蛋白在模型对照组大鼠肺组织中高表达，经80～160 mg/kg剂量范围内的当归挥发油治疗后，其表达水平明显降低(表2)。

2.3 当归挥发油对实验性哮喘大鼠肺组织病理改变的影响 见图2、表3与表4。如图2所示，正常对照组大鼠肺组织经HE染色后，在显微镜下炎症性表现不甚明显(图2 Group A)，而模型对照组大鼠肺组织可见明显的炎症反应:支气管上皮细胞肿胀、脱落，基底膜增生、变厚，支气管壁充血、水肿并有大量炎细胞浸润(图2 Group B);各给药组亦存在不同程度的上皮细胞脱落、支气管壁充血、水肿及炎症细胞浸润等表现，但较模型对照组明显减轻(图2 Group C、D、E、F)。同时，对大鼠支气管壁上皮细胞脱落程度与炎性细胞浸润程度进行半定量分析，结果显示，模型对照组与正常对照组比较，大鼠支气管壁上皮细胞脱落程度与炎性细胞浸润程度明显较重(P＜0.01)，各给药组上皮细胞脱落程度与炎性细胞浸润程度有不同程度的减轻，平均级数有所下降，其中当归挥发油高剂量组与模型对照组相比有统计学意义(P＜0.05)。

表1 当归挥发油对哮喘大鼠造模过程中行为学的影响(±s)Tab．1 Effect of VOA on asthmatic rat's behaviors under bronchial motivation by OVA(±s)

表1 当归挥发油对哮喘大鼠造模过程中行为学的影响(±s)Tab．1 Effect of VOA on asthmatic rat's behaviors under bronchial motivation by OVA(±s)

Note:Compared with group B(model group)，1)P＜0.01，2)P＜0.05.

Score Group A - 9 2.3±1.81) 9 2.8±0.41)Groups Dose(mg/kg)28 d 42 d n Score n Group B - 9 8.2±2.4 9 9.9±3.0 Group C 0.5 9 1.9±1.11)8 1.9±0.41)Group D 160 9 4.2±2.21)9 4.6±0.91)Group E 80 9 5.0±2.12)9 5.8±1.81)Group F 40 9 5.3±2.62)9 5.6±1.91)

图1 大鼠肺组织中T-bet、GATA-3与相应β-actin蛋白表达的Western blot分析Fig．1 Analysis expression of T-bet，GATA-3 and their β-actins of lung tissue of the asthma in rats

表2 当归挥发油对哮喘大鼠肺组织中T-bet和GATA-3蛋白表达水平的影响Tab．2 Effect of VOA on expression of T-bet，GATA-3 and their β-actins of lung tissue of the asthma in rats

图2 当归挥发油对实验性哮喘大鼠肺脏病理的影响(HE染色;×20)Fig．2 Effect of VOA on lung tissue histological changes of the experimental asthma in rats(HE staining;×20)

表3 当归挥发油对实验性哮喘大鼠支气管壁上皮细胞脱落程度的影响(±s)Tab．3 Effect of VOA on shedding epithelial cell of bronchus wall of the experimental asthma in rats(±s)

表3 当归挥发油对实验性哮喘大鼠支气管壁上皮细胞脱落程度的影响(±s)Tab．3 Effect of VOA on shedding epithelial cell of bronchus wall of the experimental asthma in rats(±s)

Note:Compared with group B(model group)，1)P＜0.01，2)P＜0.05.

Groups Dose(mg/kg) n Shedding epithelial cell-(0) +(1) ++(2) +++(3)Average series R Value(95%Confidence interval)Group A - 9 7 2 0 0 0.22 0.09±0.191)Group B - 9 0 0 5 4 2.44 0.79±0.19 Group C 0.5 8 0 5 3 0 1.38 0.41±0.202)Group D 160 9 0 5 4 0 1.44 0.44±0.192)Group E 80 9 0 3 5 1 1.78 0.56±0.19 Group F 40 9 0 2 5 2 2.00 0.63±0.19

表4 当归挥发油对实验性哮喘大鼠支气管壁炎性细胞浸润程度的影响(±s)Tab．4 Effect of VOA on inflammatory cell of bronchus wall of the experimental asthma in rats(±s)

表4 当归挥发油对实验性哮喘大鼠支气管壁炎性细胞浸润程度的影响(±s)Tab．4 Effect of VOA on inflammatory cell of bronchus wall of the experimental asthma in rats(±s)

Note:Compared with group B(model group)，1)P＜0.01，2)P＜0.05.

Groups Dose(mg/kg) n Inflammatory cell of bronchus wall-(0) +(1) ++(2) +++(3)Average series R Value(95%Confidence interval)Group A - 9 8 1 0 0 0.11 0.07±0.191)Group B - 9 0 0 6 3 2.33 0.78±0.19 Group C 0.5 8 0 6 2 0 1.25 0.38±0.202)Group D 160 9 0 5 4 0 1.44 0.46±0.192)Group E 80 9 0 4 4 1 1.67 0.54±0.19 Group F 40 9 0 2 6 1 1.89 0.63±0.19

3 讨论

支气管哮喘(简称哮喘)是呼吸系统的常见病、多发病，是一种由T淋巴细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞等多种炎性细胞参与的气道慢性炎症性疾病。近二十年来尽管已经采取包括吸入糖皮质激素在内的综合抗炎治疗方案，但流行病学调查发现哮喘的发病率、死亡率并没有随之而降低[5]，仍然迫切需要去寻找新的方法来防治哮喘。当归是常用中药之一，传统理论认为当归和血、行血、补血，“和血而降气、畅血而行气”，“故主咳逆上气”。当归主要含有挥发油和水溶性成分，其中挥发油被认为是治疗哮喘的主要有效部位，临床研究显示，用当归挥发油丸治疗哮喘24例，总有效率可达90.2%[6];以当归挥发油为主要有效成分的当归喘痛宁治疗喘息型支气管炎及支气管哮喘61例，有效率为81.2%[7]。豚鼠离体气管平滑肌实验显示，当归挥发油及其中所含中性非酚性部位能舒张豚鼠离体气管平滑肌，可对抗Hist、Ach所致豚鼠离体气管平滑肌的痉挛性收缩作用[1]。本课题组在当归“主咳逆上气”治疗支气管哮喘的传统理论与临床应用的指导下，在当归挥发油对豚鼠离体气管解痉有效的前期研究的基础上，采用OVA与氢氧化铝致敏、OVA雾化吸入激发来复制哮喘动物模型，观察当归挥发油平喘、治疗支气管哮喘的作用及其机制。在OVA雾化致敏过程中，观察大鼠打喷嚏、抓鼻甚至哮喘样症状并进行计分，实验结果显示当归挥发油能明显减少大鼠在激发过程中的行为综合评分;肺组织病理显示，当归挥发油可减轻支气管上皮细胞脱落、支气管壁充血水肿及炎症细胞浸润等表现，对支气管壁上皮细胞脱落程度与炎性细胞浸润程度进行半定量分析，当归挥发油高剂量组可明显减轻上述病理指标。

1986 年，Mosmann[8]根据分泌细胞因子谱及其功能的不同，将CD4+T细胞分为Th1和Th2两种亚群，近30年来，该分类方法形成了理解CD4+T免疫作用机制的框架，也形成了哮喘发病的免疫学机制，即以Th2占优势的Th1与Th2细胞及其相关因子的免疫失衡是哮喘的主要原因[9]。转录因子淋巴细胞T盒(T-bet)与GATA结合蛋白3(GATA-3)是Th1与Th2细胞的特异性转录因子，在Th细胞的分化中发挥重要调控作用。T-bet是Th1细胞发育的主要开关，通过IFN-γ-STAT1(信号转导及转录活化因子1)信号使其表达增加，活化的T-bet能诱导产生大量IFN-γ等Th1类细胞因子而抑制Th2类细胞因子的产生;GATA-3仅在Th2细胞中表达，通过IL-4/STAT6信号使GATA-3表达增加，活化的GATA-3进入胞核，上调Th2类细胞因子表达，从而促进Th2分化，抑制Th1分化。本次实验结果显示，当归挥发油可明显促进肺组织T-bet的表达而抑制GATA-3的表达，调节T-bet/GATA-3免疫平衡，这也是当归挥发油平喘的作用机制之一。

1 吴国泰，任 远，王 锋et al.当归挥发油不同部位对豚鼠离体气管平滑肌的作用及机制研究[J].甘肃中医学院学报，2011;28(4):1-4.

2 刘中成，张艳芬.一种大鼠慢性哮喘模型的建立与评价[J].药效学报，2010;45(6):718-723.

3 刘建文，季 光.药理实验方法学[M].北京:化学工业出版社，2003;136-141.

4 王力宁，李志峰，陈平兰et al.六味地黄颗粒对哮喘大鼠血清NO及肺组织NOS水平影响的研究[J].广西中医药，2011;34(1):47-52.

5 苏奎国，姜良铎，郭勇英et al.桑苏饮对哮喘模型大鼠气道重塑及肺组织上皮细胞ICAM-1表达的影响[J].山东中医药大学学报，2010;34(4):354-357.

6 王锁才，彭长福，唐敏章et al.当归挥发油丸对支气管哮喘止喘作用的临床观察[J].天津中医，1986;(1):4-5.

7 马 慧，董惠芸.当归喘痛宁治疗喘息型支气管炎及支气管哮喘疗效观察[J].甘肃中医，1998;11(4):17-17.

8 Mosmann T R，Cherwinski H，Bond M W et al.Two type sofmurine helper T cell clone.I.Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins [J].J Immunol，1986;136(7):2348-2357.

9 Robinson W H，Ying H，Miceli M C et al.Extensive polymorphism in the extracellular domain of the mouse B cell differentiation antigen Lyb-2/CD7[J].J Immunol，1992，149:880-886.