陈 凯 吴 丹 聂庆东 相 平 任 杰 李会强

(天津医科大学医学检验学院免疫学教研室，天津300140)

促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)是一种调控红细胞生成的糖蛋白激素，主要由肾脏近曲小管附近的细胞合成和分泌，能刺激骨髓红细胞的生成和释放，从而调节红系祖细胞存活、增殖、分化及成熟的造血因子，具有维持外周血中红细胞、血红蛋白恒定的作用，血液中EPO的水平能反映机体红细胞生成的能力。因此测定血液病贫血患者血清中EPO水平，对了解各类贫血的发病机制有一定价值，同时可为患者纠正贫血症状提供依据。目前检测EPO的方法有酶联免疫、放射免疫及化学发光免疫等，作为近年兴起的新型定量免疫学检测技术，光激化学发光免疫分析(Light initiated chemiluminescence assay，LiCA)技术，其具有灵敏度高、时间分辨能力强、线性范围宽、背景荧光低、免洗板、性质稳定、快速简便、易于微型化自动化等优点，代表了现在及未来分析检测技术的发展趋势。本研究利用发光微粒和感光微粒两种核心物质的光特性，建立了一种新的快速定量检测血浆EPO浓度的双抗体夹心模式的LiCA方法，并对该法的重复性、敏感性、抗干扰性及回收率等指标进行了评估。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床资料 阳性血清标本51例来自中国医学科学院血液学研究所血液病医院，采用由北京东亚免疫技术研究所提供的EPO放射免疫分析试剂盒检测。100例正常人血清来源于天津市北辰医院身体健康、无贫血指标异常的体检人群，均经过血常规检查，红细胞及血红蛋白均无异常，其中男性47例，女性53例，年龄22～65岁，平均(44±11)岁，红细胞(4.55±0.6)×1012L-1，血红蛋白(131±20)g/L。

1.1.2 材料和仪器 LiCA通用液[链霉亲和素(SA)包被的感光微粒]及发光微粒购自上海博阳生物有限公司。三株EPO抗体及EPO标准品(30 ng/ml)由天津沃克生物科技有限公司提供。96孔微孔板及LiCA HT荧光检测仪为上海博阳公司提供。

1.2 方法

1.2.1 抗体包被发光微粒 依据博阳7 000系列微球包被程序，通过发光微粒悬液处理，抗体透析，混合，反应，封闭，清洗几个步骤，将抗体共价结合于发光微粒。

1.2.2 抗体与生物素连接 抗体的准备:将抗体置于0.1 mol/L 缓冲液(0.1 mol/L、Na2CO3/NaHCO3，pH9.5)中充分透析，其间换液数次，测抗体浓度，调浓度至1 mg/ml。按摩尔比5∶1混合生物素和抗体，室温搅拌反应1小时。在4℃下用0.1 mol/L PBS(pH7.4)溶液透析24小时，其间换液数次，充分去除未结合的生物素。

1.2.3 双抗体夹心模式LiCA检测步骤 将25 μl标准品/待测血浆标本分别加到相应反应孔内，每个标本重复测定2次;每孔加入25 μl的发光微粒抗体;每孔加入25 μl的生物素化抗体;把已加好的反应板放入LiCA仪中，37℃振动孵育30分钟;每孔加入LiCA通用液(链霉亲和素化感光微球)175 μl，再孵育15分钟;读取光信号值(孵育和检测均在LiCA HT自动完成)。

1.2.4 标准品的制备 用标准品缓冲液将EPO标准液配制成 0、0.03、0.3、3、15 及 30 ng/ml的系列浓度，4℃保存备用。

1.2.5 三种抗体的筛选 1、2、3号抗体分别进行发光微粒包被及生物素化，将标记抗体的发光微粒1∶100稀释，将生物素化EPO抗体1∶1 000稀释，检测EPO 0 ng/ml及30 ng/ml标准品，每个浓度重复测定2次，采用棋盘格滴定法，通过LiCA检测仪进行检测，并得出光信号值及信噪比，根据较高信号值及信噪比筛选出双抗体组合。

1.2.6 最佳反应浓度的筛选过程 选用1∶100、1∶200、1∶300的1号抗体标记的发光微粒分别与1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000 的 2 号生物素化抗体进行组合，然后对浓度为0 ng/ml、30 ng/ml的标准品进行检测，每个浓度重复2次，采用棋盘格滴定法，通过LiCA检测仪进行检测，并得出光信号值及信噪比，根据较高信号值及信噪比筛选出最佳反应浓度。

1.2.7 检测方法的性能验证

1.2.7.1 标准曲线的建立 以标准品浓度为横坐标，信号值为纵坐标，通过ELISA Calc软件进行双对数函数转换模式的拟合处理，建立标准曲线。

1.2.7.2 灵敏度 以零参考标准品当作样品测量15次，计算其均值及标准差。以其测定值的均值加上2倍的标准差所得信号值为检测信号值，由标准曲线得出的浓度，即为其灵敏度[1]。

1.2.7.3 精密度 取3个浓度血清质控品进行测定，各设10个复孔，计算各质控品检测值的均数、标准差及CV值，为分析内精密度;对3个浓度血清质控品连续检测15天，各设1复孔，计算各质控品检测值的均数、标准差及CV值，为分析间精密度[2]。1.2.7.4 添加回收试验 回收率取2份质控血清(即已知浓度的标准血清)，分别加入3份不同浓度的标准品(即样品浓度)，测回收率。回收率=(实际浓度/理论浓度)×100%。

1.2.7.5 干扰试验 检测本实验研发的光激化学发光免疫分析方法在干扰性物质(溶血、高血脂、高胆红素)存在的情况下检测标本的准确性。我们对已知浓度的样本加入血红蛋白、甘油三酯和胆红素进行测定，计算回收率。

1.2.7.6 Hook效应 将参考标准品抗原稀释成不同浓度进行测定。

1.2.7.7 方法学比较 同时用研发的双抗体夹心光激化学发光方法及放射免疫分析方法检测正常及高值EPO标本各51份，并进行相关性分析。

1.2.7.8 正常参考值范围 用我们建立的光激化学发光方法检测100份健康人血清，统计血清EPO水平的分布情况。数据采用统计软件SPSS19.0进行处理。

1.3 统计学分析 采用SPSS19.0软件和ELISA Calc对结果进行统计分析，所有数据进行正态性检验，服从正态性分布的计量资料采用±s表示，采用pearson检验进行相关分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义，P＜0.01为差异具有显著性意义。

2 结果

2.1 确定最佳双抗体组合 1、2、3号抗体分别进行发光微粒包被及生物素化，按经验将标记抗体的发光微粒1∶100稀释，将生物素化EPO抗体1∶1 000稀释，检测EPO 0 ng/ml及30 ng/ml标准品，每个浓度重复测定2次，采用棋盘格滴定法，通过LiCA检测仪进行检测，根据信号值、信噪比(S/N)值，得出1号抗体标记发光微粒和2号抗体标记生物素为最佳组合，其信号值及信噪比最高。结果见表1。

表1 抗体标记发光微粒与生物素化抗体配对结果(平均值)Tab．1 The result of combination between antibody-labeled light emitting particles and biotinylated antibody(Mean)

2.2 确定最佳反应浓度 根据经验我们选用1∶100、1∶200、1∶300 的 1 号抗体标记的发光微粒分别与 1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000 的 2 号生物素化抗体进行组合，然后对浓度为0 ng/ml、30 ng/ml的标准品进行检测，每个浓度重复2次，采用棋盘格滴定法，通过LiCA检测仪进行检测，根据其信号值和信噪比(S/N)值。得出1号抗体标记的发光微粒浓度为1∶100和2号抗体标记的生物素浓度为1∶1 000为最适反应浓度，结果(平均值)见表2。

2.3 标准曲线的建立 用小牛血清作为稀释液倍比稀释 EPO 标准品(30 ng/ml)，浓度为 1、5、10、15以及30 ng/ml，浓度的常用对数(lgN)作为横坐标，光信号的常用对数(lgG)作为纵坐标，绘制标准曲线，见图1，线性方程为 y=1.144 x+3.156;r2=0.998 16。

2.4 灵敏度 以“0”标准品当作样品测量15次，计算其均值及标准差。以其测定值的均值加上2倍的标准差所得信号值为检测信号值，由标准曲线方程，得出(双抗夹心法)光激化学发光法检测EPO的灵敏度为0.09 ng/ml。

2.5 精密度 用含3、10、30 ng/ml EPO抗原的溶液各测定10个复孔，其批内变异系数(CV)分别为2.71%、2.10%和3.79%。对三个水平EPO抗原的溶液，连续测定15天，其批间CV分别是3.26%、3.11%和4.05%，批内平均变异系数为2.93%，批间平均变异系数为3.86%，结果见表3。

表2 1号抗体标记发光微粒及2号抗体标记生物素浓度配比信号值Tab．2 The concentration ratio signal value of No．1 antibody-labeled light emitting particles and No．2 biotinylated antibody

2.6 添加回收试验 将EPO抗原浓度为30 ng/ml和15 ng/ml的标准品，分别与 EPO浓度为10 ng/ml、3 ng/ml的标本按体积比为 1∶9 混合，通过LiCA法测得混合后样本的浓度，计算测定值与理论值的比值，从而得出其回收率，见表4、5。

2.7 干扰试验 准备无溶血、脂血及黄疸的新鲜混合血浆样本，EPO浓度为13.29 ng/ml。按体积1∶1比例分别加入高浓度的血红蛋白(Hb)、甘油三酯(日常工作时预留)、总胆红素(日常工作时预留)的干扰血浆，从而获得干扰样品，用同样的方法加入等量的去离子水作为对照样品，每个样品按照随机次序测定10次，取干扰样品和对照样品各自测定值的均数计算百分比(干扰样品测定值/对照样品测定值×100%)，以＜90%和＞110%作为判断干扰具有临床意义的标准，在干扰物溶血标本血浆血红蛋白＜20 g/L;脂血标本甘油三酯＜10 mmol/L;黄疸标本总胆红素＜200 μmol/L时，检测结果均不受干扰。结果见表6。

图1 双抗体夹心光激化学发光检测EPO标准曲线Fig．1 The standard curve of double-antibody sandwich LiCA detect EPO

表3 双抗体夹心光激化学发光精密度Tab．3 The precision of double-antibody sandwich LiCA

2.8 Hook效应 用BASE稀释EPO标准品，浓度为 1、3、5、7.5、10、15、25、30(ng/ml)共 8 个浓度值，每个浓度样品重复测定4次，计算各浓度值测定值的均数，本检测方法在EPO浓度为0～30 ng/ml内未见Hook效应(见图2)。

2.9 方法学比较 同时用研发的双抗体夹心光激化学发光方法及放射免疫分析方法检测正常及高值EPO标本各 51份，两种检测结果相比较，用SPSS19.0进行线性相关分析，结果(图3)显示两种方法在0.01(双侧)水平显著相关，r=0.957。

2.10 正常参考值范围 用我们建立的双抗体夹心光激化学发光方法检测100份正常人血标本，来源于身体健康，无贫血指标的体检人群，其中男性47人，女性53人，每份样品进行双孔测定，数据采用统计软件SPSS 19.0进行处理。统计血清EPO水平的分布情况，计算均数及标准差，这100人份的EPO浓度值经正态性检验为正态分布，均值为3.78 ng/ml，标准差为1.54。医学参考值范围的制定通常采用百分位数法，以2.5～97.5百分位值作为参考值范围。双抗体夹心光激化学发光法检测EPO参考值范围:为0.76～6.80 ng/ml。

表4 回收系列样品的配制Tab．4 The preparation of recovery test sample

表5 回收实验结果Tab．5 The result of recovery test

表6 血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰实验结果Tab．6 The interference test result of hemoglobin，triglycerides and bilirubin

图2 双抗体夹心模式LiCA Hook实验检测信号值Fig．2 The Hook experiment signal value of double-antibody sandwich LiCA

图3 两种方法检测EPO相关性分析Fig．3 Correlation of two detect EPO methods

3 讨论

促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)是最早发现并运用于临床的造血生长因子之一。在成人体内，EPO绝大部分由肾脏产生，少量来自肝脏(胎儿及新生儿则主要依靠肝脏产生)。机体缺氧是肾脏分泌EPO的基本动力，肾脏通过相应细胞(肾皮质细胞等)感受机体血氧浓度的变化，对EPO的产生进行调控，从而参与红细胞的生成过程。一旦机体表现缺氧(由贫血、血容量减少等引起)，肾脏即分泌大量的EPO进入血液，随血液循环到达骨髓，作用于造血干细胞，促使红细胞增生，直到红细胞的携氧量达到机体正常水平。作为促使造血干细胞分化的重要成分，对于红细胞生成有着决定性的作用[3]。临床上EPO的检测主要是通过测定血清或尿样中EPO的含量，分析机体内EPO水平，借此判断贫血程度及贫血原因。

本研究采用的LiCA技术[4]是一种通过化学发光检测微球间的结合，进而检测分析物含量的方法。在680 nm的激发光照射下，感光微球中的光敏物质受到激发产生单线态氧，单线态氧扩散至发光微粒，与其中的发光物质反应，即产生化学发光。由于单线态氧在溶液中维持活性的时间很短(约4 μs)，只有那些通过待测物连接在一起的发光微粒和感光微球才能产生化学发光。纳米级的微球增加了反应表面积，极大地提高了检测灵敏度;恰当的荧光波长及时间分辨计数模式，有效提高了信噪比，增加了反应的特异性。本研究通过生物素化EPO抗体与待测样本中的EPO及抗EPO抗体包被的发光微粒以双抗体夹心模式结合，再与链霉亲和素结合的感光微球共同组成反应体系，在激发光照射下产生单线氧的能量转移，从而产生化学发光，待测样本的EPO浓度与发光强度呈正相关。该方法检测EPO的灵敏度较低为0.09 ng/ml;批内变异系数和批间变异系数分别为2.93%和3.86%;此外我们检测51例EPO增高及51例健康体检者EPO的结果与目前常用的放射免疫法检测EPO结果比较具有良好的相关性(r=0.957)，本检测方法的参考范围为0.76～6.80 ng/ml。此外，本方法操作步骤简单方便，具有较好的抗干扰性、较宽的线性范围(0.09～30 ng/ml)，EPO浓度高达30 ng/ml时无Hook效应，是一种实用可靠的检测方法。目前，本研究完成了双抗体夹心模式光激化学发光EPO检测方法的建立及方法学评价，对于临床上的应用价值还有待对大量临床标本检测结果进行分析及验证。

1 冯仁丰.分析灵敏度(检测限)[J].上海医学检验杂志，2002;17(5):133-136.

2 黄 颖.标记免疫分析的质量控制和标准化[J].标记免疫分析与临床，2006;13(4):240-243.

3 姑丽鲜·热依木，夏木西卡马尔·买买提明，田刚.促红细胞生成素在临床中的应用[J].检验医学与临床，2009;6(24):2157-2158.

4 高云朝.光激化学发光技术研究进展与应用[J].中华检验医学杂志，2009;32(4):474-476.