王国戗 赵英政 裴利宏 娄婷叶 (新乡医学院第一附属医院检验科，卫辉453100)

天然CD4+T细胞在不同细胞因子环境中激活可分化为4类不同的 T细胞亚群，即:Th1、Th2、Th17、Treg细胞亚群。Th17细胞和调节 T细胞(Tregs)是新发现的两类不同于Th1型和Th2型的CD4+T细胞亚群。Th17细胞主要分泌IL-17A、IL-17F、IL-6及肿瘤坏死因子(Tumornecrosis factor，TNF)-α、IL-21、IL-22、巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)，而不分泌IFN-γ和IL-4为特征的CD4+T细胞。Th17细胞被认为是一类重要的介导炎症反应及自身免疫的细胞[1]，在自身免疫性疾病、抗胞外菌感染、介导慢性炎症及肿瘤等过程中发挥重要作用。CD4+CD25+调节性 T细胞(Regulatory T cells，Treg)是一类特异性表达转录因子Foxp3、具有免疫负性调节功能的CD4+T细胞，可通过细胞间接触抑制及分泌抑制性细胞因子(如lL-10、TGF-β)等途径发挥抗炎和维持自身免疫耐受的作用。Th17细胞同Treg细胞密切相关，都是从天然CD4+T细胞分化而来，在发育和功能上既相互联系，又相互牵制[2]。Th17细胞/Treg细胞在自身免疫性疾病的发生发展中的作用报道的比较多，而关于其在结核性疾病中的作用国内外报道还很少，且所持观点也不一致[3-5]。为此，本研究采用流式细胞术(FCM)，同时检测Th17细胞和Treg细胞在结核病患者和健康对照者外周血中的表达，分析并比较外周血中Th17/Treg细胞变化，探讨Th17细胞和Treg细胞在结核病发病中的作用。

1 材料与方法

1.1 标本来源 本研究所用标本均来自我院结核病区2011年6月至2012年12月初次来我院门诊就医的患者，尚未进行药物治疗。其中健康对照组34例，平均年龄(33.6±8.7)岁，男性24例，女性10例;空洞型肺结核病人21例，平均年龄(35±6.9)岁，男性16例，女性5例;浸润性肺结核29例，平均年龄(31±8.8)岁，男性21例，女性8例;结核性胸膜炎25例，平均年龄(30±7.8)岁，男性19例，女性6例，以上各型结核病均符合中国结核病诊断标准，对入选的结核病人均排除了其他病原体的感染，并且排除了患有自身免疫性疾病。

1.2 实验方法 将上述人群分为四组:第一组，健康对照组;第二组，空洞型肺结核病人组;第三组，浸润性肺结核病人组;第四组，结核性胸膜炎病人组。采集上述四组人群的外周静脉血，分别检测Th17免疫细胞和Treg免疫细胞在CD4+T细胞中的表达率以及Th17免疫细胞/Treg免疫细胞的比值，各项操作均严格按照说明书进行，具体操作简略如下。

1.2.1 Th17细胞的检测 外周血单个核细胞(PBMC)的提取:所有检测对象均空腹抽取肘静脉血，EDTA抗凝，按常规方法分离PBMC。(1)细胞培养:用含10%胎牛血清的RPMI1640重悬提取的PBMC;取20 μl细胞悬液加20 μl锥虫蓝，调节细胞浓度为2×106ml-1;加入PMA(终浓度为100 ng/ml)和离子霉素(终浓度1 μg/ml)并充分混匀，于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养1小时后加入莫能霉素(终浓度为1 μg/ml)混匀后继续培养5小时。(2)荧光标记CD3+CD4+IL-17+Th17细胞:取刺激培养后细胞悬液100 μl于流式管中，每管加0.5 ml固定液，振荡摇匀后室温孵育20分钟;加2 ml破膜洗液，振荡摇匀后室温孵育20分钟，离心后弃上清;破膜洗液洗涤和重悬细胞，加入10 μl抗人 IL-17Alexa Fluor647/CD3 FITC/CD4 PE抗体混匀后室温暗处孵育30分钟;阴性对照管则加入抗人IL-17同型对照IgG1/CD3 FITC/CD4 PE;0.5小时内上流式细胞仪检测。

1.2.2 Treg细胞的检测 用PBS重悬提取的PBMC;取20 μl细胞悬液加20 μl锥虫蓝，调节细胞浓度为1×106ml-1;加入1 ml Foxp3固定/透膜液，充分混匀后室温孵育20分钟;洗涤及1 ml Foxp3透膜缓冲液重悬细胞，暗处孵育15分钟;加入10 μl抗人Foxp3 Alexa Fluor488/CD25 PE/CD4 PerCP抗体混匀后暗处孵育30分钟;0.5小时内上流式细胞仪检测。

2 结果

2.1 外周血Th17和Treg细胞的表达情况 三组结核病人的Th17细胞在外周血的表达显著高于健康对照组人群(P＜0.05，分别为 0.009、0.003、0.000)，另外，三组结核病人之间Th17细胞的比较情况:空洞型肺结核病人组vs浸润性肺结核病人组(P=0.852)，空洞型肺结核病人组vs结核性胸膜炎病人组(P=0.670)，浸润性肺结核病人组vs结核性胸膜炎病人组(P=0.806)。健康对照组人群的Treg细胞在外周血的表达显著高于三组结核病人(P ＜0.05，分别为 0.016、0.000、0.000)，三组结核病人之间Treg细胞的比较情况:空洞型肺结核病人组vs浸润性肺结核病人组(P=0.097)，空洞型肺结核病人组vs结核性胸膜炎病人组(P=0.253)，浸润性肺结核病人组vs结核性胸膜炎病人组(P=0.544)。健康对照组人群外周血的Th17细胞/Treg细胞比值显著低于三组结核病人的Th17/Treg比值(P ＜0.05，分别为 0.005、0.000、0.000)，同样三组结核病人的Th17/Treg值之间没有显著差异(P ＞0.05，分别为 0.332、0.195、0.759)，Th17细胞和Treg细胞在不同组别人群外周血中的表达情况(%)见表1和流式细胞图，见图1、2;4组人群的Th17细胞和Treg细胞在外周血细胞比率数据分布和4组人群的Th17/Treg比值数据分布趋势见图3～5。

2.2 4组人群Th17细胞和Treg细胞之间的相关性结核性胸膜炎病人外周血Th17细胞的表达与其Treg细胞在外周血的表达呈显著负相关(r=-0.684，P=0.000＜0.05)，另两组结核病人及健康对照组人群外周血Th17细胞的表达与其Treg细胞在外周血的表达没有明显相关性(P＞0.05)，但也显示负相关趋势，详见表2。

表1 Th17细胞和Treg细胞在不同组别人群外周血中的表达情况(%)Tab．1 Expression of Th17 cells and Treg cells in peripheral blood of different groups(%)

图1 各检测组Th17细胞流式图Fig．1 Flow cytometry pictures of Th17 cells among four groups

图2 各检测组Treg细胞流式图Fig．2 Flow cytometry pictures of Treg cells among four groups

图3 4组检测人群Th17细胞表达率的分布Fig．3 The expression ratio of Th17 in four groups

图4 4组检测人群Treg细胞表达率的分布Fig．4 The expression ratio of Treg in four groups

表2 4组人群Th17细胞和Treg细胞之间的相关性Tab．2 The correlation between Th17 and Treg cells from four groups

3 讨论

图5 4组检测人群Th17/Treg细胞比值的分布Fig．5 The ratio of Th17 to Treg in four groups

关于结核病的免疫保护机制目前认为Th1细胞及其分泌的细胞因子(IFN-γ)在结核病的保护性免疫反应中的作用是非常重要的[3，6]，但是仅有 Th1细胞参与的免疫保护是不够的，其他免疫细胞和细胞因子的参与对于抗结核免疫也非常重要[3，7，8]。Th17细胞是近年发现的一种免疫细胞，它是不同于Th1和Th2免疫细胞的CD4+T细胞亚群，具有强大的促炎作用[9]。Th17细胞与Treg细胞有着密切的联系，二者在功能上互相拮抗，而在分化过程中却具有相关性，其数量及功能的异常可导致疾病的发生发展。目前关于Th17细胞与Treg细胞的研究多集中在自身免疫性疾病，在结核病中的作用还不清楚[10，11]，为此我们的研究小组设计了本项研究，以探讨Th17细胞与Treg细胞在结核病中的作用。

本研究结果显示健康对照组人群外周血Th17细胞的表达率明显低于空洞型肺结核病人组、浸润性肺结核病人组和结核性胸膜炎病人组的Th17细胞表达率，而三组病人的Treg细胞在外周血的表达率却明显低于健康对照组，三组病人的Th17/Treg比值显著高于健康对照组，这说明Th17细胞与Treg细胞与结核病免疫的病理反应密切相关。Th17细胞具有强大的促炎作用，本研究结果支持了这一点。病人组的Th17细胞显著高于健康对照组，这可能是过度表达的Th17细胞分泌了过多的炎症因子(如IL-17)，加重了病变部位的病理性损害。资料显示Th17细胞表达率与疾病的严重程度相关，并且可以作为临床结果的观察指标[12]。Treg细胞和Th17细胞功能上相互拮抗，诱导免疫耐受，在本研究中病人Treg细胞比率与健康对照组相比显著降低，导致了Th17细胞/Treg细胞比例失衡，过强的免疫反应可能导致了结核病的免疫病理损害，但更详细的免疫损害机理须进一步研究。在病毒性感染性疾病中Th17细胞/Treg细胞比例失衡在免疫病理损害中起了重要的作用[13，14]，本研究结果支持 Th17 细胞/Treg细胞比例失衡导致免疫病理损害的观点，在结核病人中Th17细胞/Treg细胞比例失衡可能对结核病的病理损害也起到了重要作用。

关于Th17细胞和Treg细胞在结核病人中所起的作用，目前国内外报道的非常少，且现有的少量报道多集中在结核疫苗所引起的Th17细胞及相关细胞因子的变化[4，8，10，15，16]，并且这些少量报道所持的结论也不一致，有研究认为Th17细胞的过量表达和结核的免疫发病机理相关[5]，且和严重程度相关[7]。也有相反的报道，认为活动性结核Th17细胞的表达量显著低于健康人[3]，并且随着抗结核的治疗时间的推移，Th17细胞逐渐增加，Treg细胞逐渐降低[17]。也有报道不支持Th17细胞分泌的IL-17因子参与结核的免疫病理损害[4]。本研究结果认为，结核病人的Th17细胞的表达量显著高于健康人，Treg细胞显著低于健康人，这种Th17细胞/Treg细胞比例的失衡，这种免疫失衡导致了免疫过强，可能与结核病人的免疫病理损害有关，因此，本文认为Th17细胞/Treg细胞比例的失衡对结核的免疫病理损害起到了重要作用，本文的观点相对倾向于Th17细胞的过量表达和结核的免疫发病机理相关，并且与严重程度相关。但是，是何种机制导致了结核病人的Th17细胞增加和Treg细胞的减少，笔者没有检索到相关文献，笔者个人认为，可能是结核菌感染后，刺激机体的天然免疫应答，比如巨噬细胞吞噬病菌后由静止状态活化，分泌一些细胞因子，这些细胞因子刺激Th17细胞增殖，再者吞噬细胞吞噬病菌后，将细菌的抗原呈递给某些免疫细胞引起一系列免疫反应，导致Th17细胞升高，当然这都是推测，还需要实验验证。本文也存在这一些不足，没有对相关细胞因子进行同步检测，本研究小组在后续的研究中将同步进行相关细胞因子的检测，做一些基础方面的研究，并扩大病人量，使研究结果更具权威性。

综上所述，本研究认为Th17细胞/Treg细胞比例的失衡，和结核病人的免疫病理损害显著相关，Th17细胞/Treg细胞比例的失衡对结核的发病起到了重要作用。

1 Zheng Y，Danilenko D M，Valdez P et al.Interleukin-22，a T(H)17 cytokine，mediates IL-23-induced dermal inflammation and acanthosis[J]Nature，2007;445(7128):648-651.

2 Bettelli E，Carrier Y，Gao W et al.Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells.[J]Nature，2006;441(7090):235-238.

3 Chen X，Zhang M，Liao M et al.Reduced Th17 response in patients with tuberculosis correlates with IL-6R expression on CD4+T cells[J].Am J Respir Crit Care Med，2010;181(7):734-742.

4 Li Q，Li J，Tian J et al.IL-17 and IFN-γ production in peripheral blood following BCG vaccination and Mycobacterium tuberculosis infection in human[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2012;16(14):2029-2036.

5 Wang T，Lv M，Qian Q et al.Increased frequencies of T helper type 17 cells in tuberculous pleural effusion. [J]Tuberculosis(Edinb)，2011;91(3):231-237.

6 杨进孙，杨江华，杨善兵et al．初次治疗的肺结核患者血清IL-17检测及意义[J]热带病与寄生虫学，2010;8(3):128-130.

7 Jurado J Q，Pasquinelli V，Alvarev I B et al.IL-17 and IFN-γ expression in lymphocytes from patients with active tuberculosis correlates with the severity of the disease. [J]Leukoc Biol，2012;91(6):991-1002.

8 Lalor M K，SmithS G，Flovd S et al.Complex cytokine profiles induced by BCG vaccination in UK infants.[J]Vaccine，2010;28(6):1635-1641.

9 Park H，Li Z，Yang X et al.A distinct lineage of CD4+T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17.[J]J Nat lmmunol，2005;6(11):1133-1141.

10 Simone C，de Cassan，Ansar A et al.Investigating the induction of vaccine-induced Th17 and regulatory T cells in healthy，mycobacterium bovis BCG-Immunized adults vaccinated with a new tuberculosis vaccine，MVA85A[J].Clin Vaccine Immunol，2010;17(7):1066-1073.

11 Wozniak T M，Saunders B M，Ryan A A et al.Mycobacterium bovis BCG-specific Th17 cells confer partial protection against Mycobacterium tuberculosis infection in the absence of gamma interferon.[J]Infect Immun，2010;78(10):4187-4194.

12 Jurado J Q，Pasquinelli V，Alvarev I B et al.IL-17 and IFN-γ expression in lymphocytes from patients with active tuberculosis correlates with the severity of the disease[J].Leukoc Biol，2012;91(6):991-1002.

13 Zhang G L，Xie D Y，Lin B.Imbalance of Th17/Tregs axis occurs in remission stage of patients with HBV related acute-on-chronic liver failure[J].J Gastroenterol Hepatol，2012;doi:10.1111/jgh.12082

14 Martinez N E，Sato F，Kawai E et al.Regulatory T cells and Th17 cells in viral infections:implications for multiple sclerosis and myocarditis[J].Future Virol，2012;7(6):593-608.

15 Gopal R，Rangel-Moreno J，Slight S et al.Interleukin-17-dependent CXCL13 mediates mucosal vaccine-induced immunity againstTuberculosis. [J]Mucosal Immunol，2013;doi:10.1038

16 Aranday Cortes E，Kaveh D，Nunez-Garcia J et al.Mycobacterium bovis-BCG vaccination induces specific pulmonary transcriptome biosignatures in mice. [J]PLoS One，2010;5(6):e11319.doi:10.1371/journal.pone.0011319.

17 李 靖，何 艳，郑煜煌et al.肺结核患者Th17和调节性T细胞在抗结核治疗过程中的变化[J].中华微生物学和免疫学杂志，2012;32(9):813-815.