武耀辉 陈芝喜 赵 慧 何赞厚 陈津岩 李志强

广州中医药大学（广州510405）

强肌健力方是著名中医专家邓铁涛教授治疗脾胃虚损型重症肌无力的经验方，在临床上应用多年，其对脾胃虚损型重症肌无力患者疗效确切［1－2］，功能补脾益气，强肌健力。本实验采用大黄复制脾虚模型，体外培养脾虚大鼠的主要免疫器官——胸腺细胞，用强肌健力方含药血清进行试验，用免疫组化方法观察PCNA和Fas蛋白表达的变化，从蛋白表达角度来揭示强肌健力方的免疫学作用机理，为临床治疗脾胃虚损型的重症肌无力提供实验依据。

1 实验材料 1.1 实验药物 强肌健力方（由黄芪、党参、白术、当归、升麻、柴胡、陈皮、甘草组成）按照回流提取法煎煮，70℃水浴浓缩成3g／mL；大黄按1：5加入沸水煮沸12min，趁热过滤，煎煮两次，滤液合并浓缩成2g／mL（以上中药均由广州致信药业提供，经本校中药学院鉴定）。

1.2 实验动物 SPF级SD大鼠8周龄，雄性，体重200～220g，由广东省医学实验动物中心提供，动物许可证号为SCXK（粤）2008－0002。

1.3 主要试剂 增殖细胞核抗原（PCNA）抗体、即用型SABC免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒：由博士德生物有限公司提供，批号：20091200；FAS抗体、即用型SABC免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒：由博士德生物有限公司提供，批号：20100400；刀豆蛋白 A（ConA）由sigma公司提供，RPMI－1640培养基由吉诺生物医药技术有限公司提供。

2 实验方法 2.1 含药血清的制备 大鼠在适应性喂养2d后，采用随机法将9只动物分为两组，即①强肌健力方组（7只），灌服强肌健力方药液2mL／200g，给药剂量为23.4g／kg，1d1次，连续给药5d；②正常血清对照组（2只），灌服等量的蒸馏水，1d1次，连续5d；在末次灌胃后1h，从眼眶静脉丛穿刺取血，4℃静置2h后，2000rpm离心10min，取血清，各组合并后在56℃水浴灭活30min；无菌条件下过滤除菌；－40℃冰箱保存备用。

将RPMI－1640（含10%胎牛血清）培养液中加入含药血清，体积分数为10%（即10mL含药血清加培养液至100mL）的为低含药血清组；中20%，高30%依此类推，得到各浓度含药血清组，即分别为：①QJJL低血清组（10%）；②QJJL中血清组（20%）；③QJJL高血清组（30%）；④正常血清组（含正常大鼠血清为20%）；共4组血清。

2.2 脾虚胸腺细胞的分离培养 2.2.1 大鼠随机分为2组，即脾虚模型组（15只），正常对照组（7只）。脾虚模型的复制参照文献稍作修改［3］，脾虚模型组每天灌服200%的大黄水煎液2mL／200g，连续20d；正常对照组每天灌服蒸馏水2mL／200g，连续20d。

2.2.2 将脾虚模型组大鼠颈椎脱臼处死，立即放入75%酒精中浸泡消毒3～5min，在超净工作台上无菌条件下取出胸腺。胸腺组织用PBS液冲洗1次，在器皿中用眼科剪将其粗略剪成小块，用无菌毛玻璃磨碎，于不锈钢网200目过滤，1640同时不断冲洗，得到的细胞液，800rpm离心8min后液体弃上清液，取细胞层，依次加纯水和高渗盐水破裂红细胞，PBS液洗2遍。台盼蓝染色液法检测细胞的活力＞90%。

2.3 实验分组及指标测定 随机将脾虚模型大鼠的原代胸腺细胞分为五组，即①QJJL低血清组（10%），②QJJL中血清组（20%），③QJJL高血清组（30%），④胎牛血清组（20%胎牛血清），⑤正常血清组（正常大鼠血清20%）。重悬于RPMI－1640含药完全培养基的细胞，每组5个复孔，每孔加1mL细胞悬液，即细胞数为4×107个，再分别加入含①～⑤血清培养液1mL，每孔加入ConA，浓度为10ug／mL，培养72h后分离细胞，吸取细胞上清液保存，余留细胞用50uLPBS液调均浓度，取10uL／片涂片，做免疫组化观察。

2.4 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件进行统计学分析，结果均以（±s）表示，组间比较采用方差分析，进一步两两比较，采用LSD检验，以P＜0.05为有统计学意义。

3 结 果 3.1 胸腺细胞PCNA表达比较 结果显示：QJJL中血清组胸腺细胞PCNA蛋白表达增多，表达细胞阳性面积、阳性面积率、累积光密度均明显高于胎牛血清组、正常血清组（均P＜0.01）；QJJL中血清组与QJJL低血清组、QJJL高血清组比较，细胞PCNA蛋白表达均显著增多（均P＜0.01）。PCNA阳性细胞表现为细胞核呈棕褐色或棕黄色。QJJL中血清组染色较深，细胞核和胞浆均染色，大多为棕褐色；QJJL低、高血清组也有染色；正常血清组和胎牛血清组染色细胞数目少，染色轻微。见表1、图1。

表1 各组胸腺细胞PCNA表达比较（±s）

表1 各组胸腺细胞PCNA表达比较（±s）

注：与胎牛血清组比较△P＜0.01；与正常血清组比较▲P＜0.01，与QJJL低血清组比较◇P＜0.01；与QJJL高血清组比较◆P＜0.05

组别 n（视野） 阳性面积 阳性面积率（＊100） 累积光密度QJJL低血清组15 3810±666 1.240±0.217 1199.7±209.6 QJJL中血清组 15 6761±2129△▲◇◆ 2.201±0.693△▲◇◆ 2129.0±670.5△▲◇◆QJJL高血清组 15 3609±955 1.175±0.311 1136.4±300.7胎牛血清组 15 2100±428 0.684±0.139 661.2±134.8正常血清组15 2552±596 0.831±0.194 803.7±187.7

图1 各组胸腺细胞PCNA蛋白表达比较（SABC法，×400倍）

3.2 胸腺细胞Fas蛋白表达比较 结果显示：QJJL中血清组胸腺细胞Fas蛋白表达细胞阳性面积、阳性面积率、累积光密度均显著低于胎牛血清中、正常血清组（P＜0.01－0.05）；QJJL中血清组与QJJL低血清组、QJJL高血清组比较，胸腺细胞Fas蛋白表达均显著减少（均P＜0.01）。Fas蛋白主要定位于细胞浆中，少数胞膜着色，细胞膜及细胞浆呈棕黄色为Fas阳性细胞。QJJL中血清组染色很少，也很浅，其余组别胞膜和胞浆染色的细胞明显增多。见表2、图2。

表2 各组胸腺细胞Fas蛋白表达比较（±s）

表2 各组胸腺细胞Fas蛋白表达比较（±s）

注：与胎牛血清组比较△P＜0.01；与正常血清组比较▲P＜0.01；与QJJL低血清组比较◇P＜0.01；与QJJL高血清组比较◆P＜0.05

组别 n（视野） 阳性面积 阳性面积率（＊100） 累积光密度QJJL低血清组15 4001±546 1.303±0.178 1260.2±172.0 QJJL中血清组 15 2258±398△▲◇◆ 0.735±0.130△▲◇◆ 711.1±125.5△▲◇◆QJJL高血清组 15 3088±811 1.005±0.264 972.4±255.3胎牛血清组 15 2904±540 0.945±0.176 914.6±170.1正常血清组15 6449±925 2.100±0.301 2030.9±291.2

图2 各组胸腺细胞Fas蛋白表达比较（SABC法，×400倍）

4 讨 论 免疫系统包括中枢免疫器官和外周免疫器官，中枢免疫器官是免疫细胞产生、成熟和分化的场所，胸腺属于中枢免疫器官。胸腺是最先产生淋巴细胞的器官，它是免疫系统发育和执行功能的中枢。胸腺并不直接参与免疫应答，但它提供T细胞发育成熟所必需的微环境［4］。胸腺还具有胸腺屏障的功能，可以防止外来的和随血液的病原体及抗原异物穿过血管壁进入胸腺实质内，以避免引起肌肉交接处乙酰胆碱受体的自身免疫抗体，防止破坏神经后突触膜和阻碍其信息传导，引发重症肌无力等症。

PCNA是真核生物DNA合成所必须的一种相对分子量为36KD的酸性核蛋白，为DNA聚合酶的推动因子［5］。PCNA和细胞周期蛋白Cyclin D是一对细胞增殖调节因子，许多细胞因子可调节二者的结合，PCNA其表达程度放映了细胞增殖活性的高低，是反映细胞增殖情况应用最普遍的抗原标记。细胞凋亡又称程序性细胞死亡，是生物体内存在的一种普遍现象，它与细胞坏死不同，它不是病理条件下自体损伤的一种现象，而是更好的适应生存环境而采取的主动死亡过程，它通过凋亡清除体内多余的或衰老的细胞，对于维持体内组织细胞的平衡和稳定具有重要作用。Fas抗原表达于多种类型的细胞表面，其配体主要表达于活化的淋巴细胞，二者的结合能迅速启动细胞凋亡。已知Fas与FasL介导的细胞凋亡，对免疫系统的发育和免疫应答的调节具有重要的作用。细胞凋亡是基因调控下进行的主动有序的死亡过程，其中Fas／Fas配体（FasL）途径在凋亡发生中发挥重要作用。从T细胞释放出来的FasL分子，既可以杀伤自已，也可以引起其它T细胞死亡，最后还可损伤被活化的B细胞，因为后者激活后可表达Fas分子，结果细胞免疫和体液免疫应答同时受到下调［6－9］。

强肌健力方是邓老临证治疗脾胃虚损型重症肌无力的经验方药，脾为后天之本，主四肢肌肉、主运化，胃主受纳；脾胃虚弱，气血生化不足，无以生肌，四肢不得禀水谷之气，故出现四肢肌肉萎缩，肌肉无力。该方取“治痿独取阳明”之意，在补中益气汤基础上重用黄芪为君，辅以党参、当归、白术、甘草等，具有补脾益损、强肌健力的功效［10］。强肌健力方含药血清对脾虚胸腺细胞的补益作用如何，是刺激还是抑制细胞的增殖呢？

本实验中，QJJL低、中、高三组含药血清的PCNA蛋白表达均明显增多，尤其是QJJL中血清组最显著（P＜0.01），说明此组DNA合成和细胞增殖最为明显；各组含药血清组的Fas蛋白凋亡表达很少，尤其是QJJL中血清组染色很少，也很浅；正常血清组和胎牛血清组Fas蛋白凋亡表达显著增多，阳性染色也比较明显。强肌健力方可以促进胸腺细胞修复、分化成熟，进而促使其增殖，蛋白合成增加，从而起到胸腺组织的修复和保护作用，这与课题组前期实验报道的强肌健力口服液能促进DNA合成的结果相符［11－13］，Fas蛋白抗原表达明显与机体免疫力呈负相关性，这说明强肌健力方能促进胸腺细胞修复损伤，延缓细胞凋亡。而且，QJJL中血清组最为显著，说明这个强肌健力方20%血药浓度也许是机体最佳浓度，刺激细胞修复和增殖最为明显，进一步说明的中医组方的精妙，也为进一步指导临床上口服药和注射剂等用药量。

［1］邓铁涛，李任先，李顺民，等.强肌健力胶囊随机双盲自身交叉对照治疗重症肌无力疗效观察［J］.广州中医学院学报，1992，9（1）：7－10.

［2］刘小斌，邓中光.强肌健力口服液治疗脾胃气虚型重症肌无力的临床观察［J］.中药新药与临床药理，2004，15（5）：361－362，364.

［3］叶 冰，彭 成.脾虚证动物模型研究进展［J］.实验动物科学与管理，2003，20（4）：42－45.

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