雷红伟 徐丽君 董 慧 邹 欣 陆付耳△

1 华中科技大学同济医学院附属同济医院中西医结合研究所，武汉 430030

2 湖北中医药大学药学院药理教研室，武汉 430065

马齿苋（Portul acaoler aceaL.）系马齿苋科马齿苋属一年生草本植物，首载于《神农本草经》。现代药理研究［1］证明马齿苋具有抗菌、降血脂、抗衰老、抗炎、镇痛、降糖以及促进伤口愈合等作用。本所前期研究［2］发现马齿苋改善2型糖尿病（T2DM）的脂质代谢，进一步的研究［3－4］发现马齿苋黄酮有效部位可改善T2DM大鼠糖耐量异常。有资料［5］表明马齿苋含有许多黄酮类的物质，为进一步明确马齿苋黄酮有效部位改善胰岛素抵抗的作用机制，本实验首次使用HPLC分析了马齿苋黄酮的相关成分，检测到其含有染料木苷并对其含量进行测定。

1 材料与方法

1.1 仪器

美国Waters公司高效液相色谱仪（Waters600 Controller，Waters 2487 Dual Absorbance Detector，Waters717 Plus Antosampler，Empower数据处理系统），色谱柱：Sunfire C18 column（250.0 mm×4.0 mm，5.0μm）（美国），VF型纯水装置（美国），BUCHI R－200型旋转蒸发仪（瑞士），WF－700型电热恒温鼓风干燥箱（日本），BT25－型1／10万电子天平（中国）。

1.2 试剂

染料木苷对照品（批号：200501）购自中国药品生物制品检定所，甲醇（HPLC纯，批号：20080610）购自天津巿科密欧化学试剂有限公司，冰醋酸（批号：20080308）购自天津巿东丽区天大化学试剂厂，无水乙醇（批号：20071015）购自天津巿广成化学试剂有限公司，马齿苋（同济医院中药房提供）由湖北中医药大学生药教研室吴和珍副教授鉴定为Portul acaoler aceaL.，马齿苋黄酮部位由本所分离、纯化。

2 结果

2.1 色谱条件

Sunfire C18 colu mn（250.0 mm×4.0 mm，5.0 μm）色谱柱（美国）；流动相：甲醇∶冰醋酸∶水＝45∶1∶55；流速：0.8 ml／min；检测波长：259 n m；柱温：25℃。在该色谱条件下，样品中被测成分能够达到基线分离，染料木苷保留时间为8.9 min。见图1。

图1 样品及对照品HPLC图

2.2 对照品溶液的制备

精密称取染料木苷对照品1 mg溶于100 ml容量瓶中，用50%甲醇定容至刻度线，超声助溶5 min，成10 mg／L染料木苷标准母液。再精密吸取10 mg／L染料木苷标准母液2.5 ml于100 ml容量瓶中，50%甲醇定容至刻度线，配成250μg／L染料木苷标准液。

2.3 样品溶液的制备

取马齿苋黄酮提取液（含生药6 kg／L）10 ml于100 ml容量瓶中，50%甲醇定容至刻度线，超声助溶5 min，得含生药0.6 kg／L马齿苋黄酮提取物溶液，再取1 ml含生药0.6 kg／L马齿苋黄酮提取物溶液于10 ml容量瓶中，50%甲醇定容至刻度线，超声助溶5min，得含生药60 g／L的供试样品溶液，0.45μm滤膜过滤备用。

2.4 线性关系考察

分别吸取8.00、4.00、2.00、1.00、0.50、0.25 ml上述250μg／L染料木苷标准液于10 ml容量瓶中，以50%甲醇定容至刻度线，依次得浓度为200.00、100.00、50.00、25.00、12.50、6.25μg／L的标准液，分别以10μl进样，测定峰面积。以对照品溶液进样量X为横坐标，峰面积积分值Y为纵坐标绘制标准曲线，染料木苷标准品在0.062 5～2.000 0 ng范围内与峰面积呈线性关系，回归方程为Y＝7 952.3X－87.876。见图2。

图2 染料木苷标准品进样量与峰面积的回归关系图

2.5 精密度考察

取100μg／L对照品溶液6份，分别以10μl进样，计算峰面积积分值RSD＝0.56%。

2.6 重现性考察

取6份供试品溶液，分别以10μl进样，计算峰面积积分值RSD＝0.93%。

2.7 稳定性考察

取同批供试品溶液，于0、2、4、6、8、10、12 h，按含量测定方法，连续进样测定6次，6次测得峰面积积分值RSD＝0.95%。

2.8 加样回收率实验

取已知含量的供试品5份，每份3 ml，分别加入含一定量染料木苷的对照品1 ml，超声助溶5 min，0.45μm滤膜过滤备用。按上述色谱条件测定，其平均回收率为98.30%，RSD＝0.57%。见表1。

2.9 样品测定

精密吸取含生药60 g／L的供试样品溶液3份，每份1 ml。以对照品溶液和样品溶液分别进样，照上述色谱条件测定，结果表明样品峰均面积为1 230，外标法计算显示含生药60 g／L马齿苋黄酮样品液含染料木苷的平均浓度为16.6μg／L，含生药6 kg／L马齿苋黄酮提取液中平均含染料木苷1.66 mg／L。

表1 加样回收实验结果

3 讨论

马齿苋隶属马齿苋科，是一年生草本植物，民间称为长寿菜。马齿苋味酸、性寒，具有清热解毒、凉血止血、散血消肿等作用，主治热痢脓血、带下、热淋、痈肿恶疮、丹毒等［6］。任洁等［7］的现代药理学研究证实马齿苋具有抗糖尿病的作用。本所前期大量的动物实验数据表明，马齿苋及其不同部位均能改善动物体内的糖、脂代谢，特别是马齿苋黄酮部位。进一步的体外实验［8］也证明马齿苋及其不同部位均能改善体外细胞的脂质代谢紊乱。马齿苋黄酮的药理学研究目前已逐渐增多，其改善胰岛素抵抗综合征的作用倍受注目。Awad［5］报道马齿苋中含有染料木素、染料木苷等异黄酮类的物质。染料木素、染料木苷等作为大豆异黄酮类物质在抗癌作用方面的研究国内外已有大量报道，近期其抗糖尿病方面的作用也引起人们的注意［9］，本所近期研究［10］也证明染料木素可改善胰岛素抵抗。为明确马齿苋黄酮改善胰岛素抵抗的作用与染料木素、染料木苷等物质间的关系，本实验根据文献［11］用RP－HPLC测定了马齿苋黄酮提取液中的染料木素。本实验发现，以甲醇∶冰醋酸∶水（45∶1∶55）为流动相的样品HPLC图中有一峰与染料木苷标准品的出峰时间一致，均为8.9 min，如图1，且被测峰与其他峰达基线分离，因此判定马齿苋黄酮提取物中含有染料木苷。染料木苷标准品在0.062 5～2.000 0 ng范围内与峰面积呈良好线性关系，r＝0.999 9，如图2。实验结果表明，精密度实验RSD＝0.56%；重现性实验RSD＝0.93%；稳定性实验RSD＝0.95%；加样回收实验RSD＝0.57%，实验方法准确可靠，可用于测定马齿苋黄酮提取物中染料木苷的含量。结果显示，含生药6 kg／L马齿苋黄酮提取液中含染料木苷，染料木素含量为1.66 mg／L。本次实验为进一步研究马齿苋黄酮有效部位改善胰岛素抵抗的作用机制提供了物质基础。

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［4］肖凤英，陆付耳，徐丽君.马齿苋不同部位对2型糖尿病大鼠胰岛形态结构的影响［J］.中国中医基础医学杂志，2006，12（5）：392－395.

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［6］国家药典委员会编.中国药典2000年版（第一部）［M］.北京：化学工业出版社，2000：158－159.

［7］任洁，周俭.马齿苋改善血糖作用的研究［J］.科技导报，2007，25（10）：15－18.

［8］肖凤英，陆付耳，徐丽君.马齿觅不同部位对高脂血清损伤脂肪细胞分泌TNF－α及IL－6的影响［J］.中国中药杂志，2005，30（22）：1763－1765.

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