李 妍 杭州师范学院医学院附属余杭医院 杭州 311100

赵久阳 大连医科大学附属二院

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是一类以进行性肾脏纤维化为特征的疾病。激肽系统（kallikrein-kinin system，KKS）对于肾小球硬化和肾间质纤维化具有明显的抑制作用[1-2]，而缓激肽（braykinin，BK）是该系统发挥效应的最终作用因子。本实验采用高糖刺激肾系膜细胞，使细胞达到预增殖状态，以磷酸化JNK 蛋白表达量代表JNK 通路的活化程度，研究BK 对高糖诱导的细胞磷酸化JNK蛋白表达的影响，深入了解BK 对糖尿病肾病肾纤维化的保护作用的机制，为临床防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 BK（美国Calbiochem），BK 受体阻断剂HOE-140（美国Sigma），RPMI 1640 培养液（美国GIBCO），D-Glu（美国Sigma），SP 600125（美国Santa Cruz），小鼠抗人P-JNK 一抗（美国Santa Cruz），辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠Ig-G 二抗（大连晨玉），胎牛血清（FBS）（天津中科院TBD），醋酸纤维素膜（NC 膜）（美国Bioshop）。

1.2 细胞培养及分组方法 细胞来源：永生代成年大鼠肾小球系膜细胞系购自美国Cambrex。细胞培养：于含10%胎牛血清（FCS）的RPMI1640 培养液、5%CO2、37℃的孵箱中传代培养，生长至80%融合时，饥饿培养24h，使细胞同步于G0 期，随后依实验目的不同分成不同试验组。

实验分组：按培养液中刺激因素不同分组，每组均为含10%灭活胎牛血清的RPMI1640 培养液。细胞分组：①对照组：培养液中测定其葡萄糖浓度为5mmol/L。②高糖组：培养液中测定其葡萄糖浓度为30mmol/L。③缓激肽+高糖组：培养液中缓激肽浓度（100ng/mL）预孵15min 后，加入葡萄糖浓度30mmol/L。④缓激肽B2 受体阻断剂＋缓激肽+高糖组：培养液HOE-140（1μmol/L）预孵15min 后，加入缓激肽100ng/mL 预孵15min，再加入葡萄糖浓度30mmol/L。⑤JNK 通路阻断剂＋缓激肽+高糖组：SP-600125（10μmol/L）预孵15min 后，再加入缓激肽100ng/mL预孵15min 后，再加入葡萄糖浓度30mmol/L。

1.3 免疫印迹（Western－blotting）法检测JNK 信号通路的激活 依据分组不同，将细胞接种在10cm 的培养皿中，生长至80%融合的系膜细胞用无血清培养基培养24h，然后吸出培养基，换用新的无血清培养基，并根据分组加入不同的作用因子，并用含有1mmol/L 钒酸钠（NaVO4）的冰冷的PBS 冲洗三次终止反应，加入蛋白裂解液（预冷）刮下细胞转移至EP管中，超声粉碎后12 000rpm 4℃离心20min 取上清。上述操作均于冰上进行，以避免蛋白降解。蛋白浓度以Bradford 分析法确定。取5μL 样品，加入95μL 双蒸水，再加入3mL Bradford 显色液后立即混匀。用紫外分光光度仪在595nm 下测定OD 值，作双管重复测定结果，通过标准曲线计算样品蛋白浓度。取样品行SDS-PAGE 电泳，90V 恒压转膜2h，用5%牛血清封闭过夜。封闭后的膜与单克隆小鼠抗人磷酸化JNK（Ⅰ抗）4℃杂交孵育1h，再与辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG 抗体（Ⅱ抗）室温孵育杂交1h。抗体均用抗体缓冲液适当稀释，杂交时轻摇抗体使之与膜均匀、充分接触，每次杂交完毕均用TTBS洗去残余未结合抗体。将硝酸纤维素膜浸于DAB 显色液中，于暗处观察，观察有清晰的特异条带出现时，用大量的水冲洗硝酸纤维素膜以终止显色反应。定影，拍照。凝胶扫描分析系统（2020D，美国Kodak）软件行图象扫描及条带吸光度半定量分析，为消除扫描和分析中的误差，重复三次该过程，并取均值作统计学分析。

1.4 统计学方法 应用SPSS13.0 软件分析数据，数据用均值±标准差（）表示，采用单因素方差分析，P＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

对照组表达一定基础水平的磷酸化JNK 蛋白，高糖组较对照组磷酸化JNK 蛋白的表达量增多，差异有统计学意义（P＜0.05）；BK 加高糖组的磷酸化JNK 的表达量与高糖组比较明显减少（P＜0.01），与对照组比差异无统计学意义（P＞0.05）；加入BK-B2 受体阻断剂后，与不加阻断剂组比磷酸化JNK 蛋白的表达量增多（P＜0.05），但仍显著低于高糖组，差异有统计学（P＜0.05）；使用JNK 通路阻断剂后，JNK 磷酸化蛋白表达量明显减少，有统计学差异（P＜0.01），见图1，图2。

图1 各组总磷酸化JNK 蛋白表达量

图2 磷酸化JNK 蛋白电泳图（P-JNK 包括P-JNK1和P-JNK2）

3 讨论

糖尿病肾病是一类以进行性肾脏纤维化为特征的疾病。在肾小球的各种类型细胞中,系膜细胞是受高血糖影响最显著的细胞。C-Jun 氨基末端激酶（CJunNH2-terminal kinase，JNK）为丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPKs）通路成员之一，是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是将胞外刺激信号传递给胞核的主要传导通路。JNK可被应激反应如渗透压的改变、热休克、炎症反应因子IL-1α、INF－α、DNA 损伤等因素所激活。体内研究发现，JNK 在肾损伤的早期发挥重要作用[3]。因此,我们选用系膜细胞作为研究对象来研究BK 对高糖诱导系膜细胞表达磷酸化JNK 蛋白的影响，探索BK延缓糖尿病肾病肾小球硬化的机制。

近年来发现激肽释放酶－激肽系统（kallikreinkinin system，KKS）对细胞的生长、细胞外基质的合成及降解起着重要的调节作用。BK 的生理作用主要由B2 受体（BKB2R）介导，B1 受体（BKB1R）在生理情况下不表达，可能在炎症、缺血或组织损伤等情况下放大BKB2R 介导的效应。

研究发现，BK 的作用与MAPK 通路关系密切，而目前研究比较清楚的是BK 对ERK 通路的影响。实验表明，BK 可以调节ERK 的激活，BK 通过抑制ERK 的激活可以调节增殖状态系膜细胞的增殖[4-5]。而BK 对JNK 通路影响的文献却很少。

Liu 等[6]报道，BK 可促进鼠的成纤维细胞JNK磷酸化蛋白的表达，即BK 可以调节JNK 通路的激活。关于BK 对系膜细胞JNK 磷酸化蛋白的影响，目前国内很少报道，研究发现BK 对系膜细胞的调节具有双向性[4，7]，即作用于静止状态的系膜细胞引起其增殖，而作用于增殖状态下的系膜细胞时起抑制增殖的作用。本实验用高糖刺激系膜细胞，使其处于增殖状态，使用B2 受体阻断剂、JNK 通路阻断剂（SP600125）后，通过检测磷酸化JNK 蛋白表达量的变化，观察BK 对高糖诱导系膜细胞表达JNK 磷酸化蛋白的影响。结果显示，高糖组表达JNK 磷酸化蛋白明显高于对照组，而BK 可以抑制高糖诱导细胞的JNK 磷酸化水平，BK-B2 受体阻断剂可以阻断BK的抑制作用，使磷酸化JNK 蛋白表达量增多，说明BK 通过B2 受体抑制高糖诱导的JNK 磷酸化蛋白的表达。而加用JNK 阻断剂可完全阻断这条通路的激活，磷酸化JNK 蛋白表达明显减少，且低于对照组水平（P＜0.01）。本研究发现BK 可抑制高糖诱导系膜细胞的磷酸化JNK 蛋白的表达。推测BK 抑制DN时的肾纤维化的作用可能是通过调节磷酸化JNK 蛋白的表达实现的。

Makkinje 等[8]研究显示，JNK 通路在DN 的持续发展过程中发挥作用。Ingram 等[9]发现，高糖（30mmol/L）的机械牵张（14kPa）可以激活体外培养的大鼠系膜细胞的JNK 通路，而P38MAPK 和ERK 活性变化不明显。相关研究报道高糖环境下导致的氧化应激状态，激活JNK/SAPK 途径，刺激系膜细胞CTGF、FN的合成，导致细胞外基质的积聚，最终导致肾小球硬化。而本实验显示，BK 可以调节JNK 通路的激活从而发挥抑制糖尿病肾病进展的作用。

转录因子AP-1 是细胞内JNK/SAPK 作用的重要目标，JNK 通路被激活后，可以通过转录因子AP-1 将细胞外刺激信号传导至细胞核，激活AP-1 位点的靶基因转录。核内立早基因c-fos、c-jun 编码的蛋白产物分别形成了Fos 家族（c-Fos、FosB、Foral、Fraz）蛋白和Jun 家族（c-Jun、JunB、Jun 与Fos）二聚体，构成转录因子AP-1。已知单核细胞趋化蛋白－1、转化生长因子-β、纤维连接蛋白（FN）、层粘连蛋白B 及细胞周期素D1 等基因启动子中均存在与AP-1 结合的作用元件（TRE 元件）。故BK 可能是通过JNK/SAPK/AP-1 途径调节转化生长因子－β、纤维连接蛋白（FN）等基因启动子的结合而发挥抑制肾纤维化作用。

综上所述，BK 作为一种细胞因子，可通过调节JNK 磷酸化蛋白表达，来调节JNK 通路的活性，从而在延缓糖尿病肾病肾小球硬化的进程中发挥重要的作用。

［1］Wolf WC，Yoshida H，Agata J，et al.Human tissue kallikrein gene delivery attenuates hypertension,renal injury,and cardiac remodeling in chronic renal failure［J］.Kidney Int，2000，58（2）：730-739.

［2］Schanstra JP，Neau E，Drogoz P，et al.In vivo bradykinin B2 receptor activation reduces renal fibrosis［J］.J Clin Invest，2002，110（3）：371-379.

［3］Hamaguchi A，Kim S，Yano M，et al.Activation of glomerular initogen-activated protein klnases in angiotensin II-mediated hypertension［J］.J Am Soc Nephrol，1998，9（3）：372-380.

［4］Celine Alric，Christiane Pechet，Eric Cellier，et al.Inhibition of IGF-1-induced Erk1 and 2 activation and mitogenesis in mesangial cells bybradykinin［J］.Kidney International，2002，62：412-421.

［5］Eric Cellier，Marilyne Mage，Johan Duchene，et al.Bradykinin reduces growth factor-induced glomerular ERK1/2 phosphorylation［J］.AmJ Physiol Renal Physiol，2003，284：282-292.

［6］Liu B，Yu J.Microarray and phosphokinase screenings leading to studies on ERK and JNK regulation of connective tissue growth factor expression by angiotensin II 1a and bradykinin B2 receptors in Rat1 fibroblasts［J］.J Cell Biochem，2006，97（5）：1104-1120.

［7］Alric C，Pecher C，Schanstra JP，et al.Bradykinin-induced inhibition of cell proliferation and tyrosine kinase activity in rat mesangial cells［J］.Int MolMed，2000，5（1）：85-93.

［8］Makkinje A，Quinn DA，Chert A，et al.Cene 33/mig-6,atranscriptionally induci-ble adapter protein that binds GTPCDC42 and activates SAPK/JNK.A potential marker transcript for chronic pathologic conditions,such as diabetic nephropathy.possible role in the response to persistent stress［J］.J Biol Chem，2000，275（23）：17838-17847.

［9］Ingram JA，Ly H，Thai K，et al.Mesangial cell signailing cascades in response to mechamical strain and glucose［J］.Kidney Int，1999，56：1721-1728.