肖德奇，乔建瓯，袁定芬

（1.上海交通大学附属第六人民医院，上海200233；2.上海交通大学附属第九人民医院，上海 200011）

特应性皮炎（atopic dermatitis，AD）是与遗传有关的，具有产生IgE倾向的一种慢性、难治性、瘙痒性、炎症性皮肤病[1]。AD真皮浸润细胞主要是T淋巴细胞，其次为抗原呈递细胞、肥大细胞及巨噬细胞[2]。其中单核-巨噬细胞在AD发病中的作用受到越来越多的关注。外周血中单核细胞进入真皮层后也称为朗格汉斯细胞（langerhans cell，LC），AD慢性皮损内LC数量明显增多。LC表面的IgE受体（CD23）与IgE结合,结合后的IgE对特异性抗原有高亲和力的捕获功能，使LC也具有高效[3]。

组蛋白脱乙酰基酶（histone deacetylase,HDAC）可以通过去除组蛋白赖氨酸上的乙酰基团来调控基因的表达，是表观遗传学中的重要分子。目前发现的HDAC家族分三类共11个分子，其中HDAC1，HDAC2，HDAC3和HDAC8属于Ⅰ类分子[4]。有文献表明，HDACⅠ类家族抑制剂可以促进单核巨噬细胞表达白细胞介素（IL）-10、IL-4，而抑制干扰素（IFN）-γ、IL-12 的表达[5]。IL-10、IL-4 均能诱使 Th2方向免疫反应，促进AD的发生发展。在本研究中，通过定量PCR检测对比AD患者和正常人外周血巨噬细胞中HDAC I类家族的表达，筛出与AD相关的具体HDAC分子，并研究其与AD发病的相关性和临床意义。

1 对象与方法

1.1 对象来源 AD组患者10例，均符合英国Williams提出来的AD诊断标准。来源于我院门诊，年龄3～62岁，平均35.1岁，病程1～32年，平均6.3年。排除妊娠及哺乳期妇女、1个月内全身应用糖皮质激素者、正患上和（或）下呼吸道感染者以及患自身免疫性疾病者。正常对照组12例选自我院体检的无过敏病史的健康人群，年龄22～55岁，平均37.2岁。

1.2 试剂和研究方法

1.2.1 Ficoll分离液常规分离人外周血单核细胞FACS液（PBS+2%BSA）悬浮细胞后加入FITC标记小鼠抗人CD11c单抗。孵育15 min后，FACS液洗2遍，流式细胞仪分选外周血单核巨噬细胞。

1.2.2 RNA的提取与cDNA的合成 采用细胞总RNA Trizol试剂提取RNA，严格按照试剂说明书操作。用紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度。取RNA 4 μL，Oligo dT Primer 1 μL，PrimeScriptTMRT Enzyme Mix 1 μL，5×PrimeScriptTMBuffer 4 μL，总反应体系20μL。72℃5min，42℃60min，得到cDNA。

1.2.3 荧光定量PCR（SYBR Green法） HDAC1，HDAC2，HDAC3和 HDAC4以及 IL-10，IL-12的反应体系和反应条件均相同。总反应体系20 μL，包括SYBR PremixExTaqTM10 μL，上下游引物各 1 μL，cDNA 模板 2 μL，dd H2O 6 μL。反应条件为：95℃预变性3 min，95℃变性 10 s，60℃退火加延长 40 s，共40个循环。疾病组单核巨噬细胞内HDAC1，HDAC2，HDAC3和 HDAC4 mRNA的表达量相对于对照组的变化用以下公式计算：folds=2-△△CT，其中△△CT=△CT（实验组）－△CT（对照组），△CT＝CT（目的基因）-CT（内参基因），CT 值表示每个反应管中的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数，CT值越小，原始模板浓度越高，基因表达量越大。

1.3 统计学方法 采用SPSS 16.10统计软件,采用Wilcoxon符号秩和检验及LSD方差分析；AD组HDAC3与IL-10、IL-12的相关性采用Pearson相关分析。

2 结果

2.1 AD患者外周血单核巨噬细胞I类HDAC家族分子表达的差异 AD患者外周血单核巨噬细胞中，I类HDAC家族分子之一的HDAC3的表达量与正常对照组相比明显下降（P=0.026）。而HDAC I类家族的其他3个分子的表达量与对照组相比没有明显的变化。HDAC1，HDAC2和HDAC8的表达量与正常对照组相比较的P值分别为0.245，0.217和0.196。见图 1。

2.2 外周血单核巨噬细胞中IL-10、IL-12的表达情况 AD患者外周血单核巨噬细胞中IL-10水平高于正常对照组,且差异有统计学意义（P＝0.029）。AD患者外周血单核巨噬细胞中IL-12水平虽低于对照组,但差异无统计学意义（P＝0.105）。见图 2。

2.3 AD患者外周血单核巨噬细胞HDAC3表达与IL-10、IL-12相关性分析 AD患者外周血单核巨噬细胞IL－10的表达与HDAC3的表达呈负相关，相关系数为r=-0.6522，与对照组相关系数相比，有统计学意义（P＝0.012）。AD患者外周血单核巨噬细胞IL-12与HDAC3的表达无直线相关性，相关系数为r=0.1436，与对照组相关系数相比，无明显差别（P＝0.325）。

3 讨论

AD的组织病理表现不具特征性,与刺激性皮炎或变应性接触性皮炎等其他皮肤病的病理表现相同。AD急性或早期的皮损特征为表皮海绵形成,散在的T淋巴细胞浸润，LCs数目增加。AD皮损中大量存在的单核细胞说明单核细胞来源的巨噬细胞在AD皮肤炎症的发生中起着重要作用，越来越受到广泛的重视。

LCs利用淋巴结中与天然T细胞的相互作用影响T细胞细胞因子分泌模式的过程称为“初”极化。LCs本身的表观遗传学变化而导致其本身极化过程是近来研究热点[6]。以分泌促炎因子为主，发挥促炎功能的巨噬细胞称为M1型巨噬细胞。以使免疫反应向Th2方向极化，能分泌IL-10、生长转换因子（TGF-β）等的巨噬细胞称为M2型巨噬细胞[7]。在AD中以M2型LCs为主。

HDAC是细胞内调控基因转录的一大类非常重要的表观遗传学分子。HDAC催化基因启动子区域的组蛋白去乙酰化，从而改变染色质构象，调节DNA与转录复合体之间的结合，进而决定基因激活或者沉默[8]。

研究表明，HDAC在免疫细胞功能调控中的作用是近来研究的热点。Grausenburger等[9]发现，HDAC1敲除的T淋巴细胞IL-4分泌增加，表现出明显向Th2分化的倾向。将HDAC 1敲除的T淋巴细胞输注小鼠体内可以明显增加小鼠气道炎症和高反应性，抗感染和肿瘤能力减弱。进一步的研究揭示了HDAC1可以直接与IL-4启动子区结合，直接调控IL-4的表达。HDAC在调节树突状细胞免疫功能分化方面也起着非常重要的作用。HDAC抑制剂可以抑制树突状细胞分泌促炎因子，增加抗炎因子的表达，降低了抗感染和抗肿瘤能力，但对自身免疫疾病有保护作用。

在本研究中，HDAC3在AD患者外周血单核巨噬细胞中低表达，同时发现HDAC3与单核巨噬细胞中IL-10的表达呈明显的负相关，说明HDAC3在巨噬细胞中低表达与AD的发病有关。这与Wu等[10]的报道相似，他们认为HDACⅠ类家族抑制剂可以促进巨噬细胞向M2方向极化，而且促进巨噬细胞诱导更为强烈的Th2免疫反应。其结果亦提示HDAC3与皮肤的变应性疾病发病存在关联。这为进一步研究表观遗传在AD发病中的机制奠定了基础，有助于人们对这些疾病的预防和治疗。

［1］The International Study of Asthma and Allergies in Childhood(ISAAC)Steering Committee.Worldwide variation in prevalence of symptoms of asthma,allergic rhino-conjunctivitis,and atopic eczema:ISAAC[J].Lancet,1998,351:1225-1232.[Noauthorslisted].

［2］Bieber T.Atopic dermatitis 2.0:from the clinical phenotype to the molecular taxonomy and stratified medicine[J].Allergy,2012,67:1475-1482.

［3］Beck LA,Dalke S,Leiferman KM,et al.Cutaneous injection of RANTES causes eosinophil recruitment:comparison of nonallergic and allergic human subjects[J].J Immunol,1997,159:2962-2972.

［4］Huangfu D,Osafune K,Maehr R,et al.Induction of pluripotent stem cells from primary human fibroblasts with only Oct4 and Sox2[J].Nat Biotechnol,2008,26:1269-1275.

［5］Ivashkiv LB.Epigenetic regulation of macrophage polarization and function[J].Trends Immunol,2012 Dec 3,pii:S1471-4906(12)00195-0.doi:10.1016/j.it.2012.11.001.[Epub ahead of print].

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［9］Grausenburger R,Bilic I,Boucheron N,et al.Conditional deletion of histonedeacetylase1inTcellsleadstoenhancedairwayinflammation and increased Th2 cytokine production[J].J Immunol,2010,185:3489-3497.

［10］Wu C,Li A,Leng Y,et al.Histone deacetylase inhibition by sodium valproate regulates polarization of macrophage subsets[J].DNA Cell Biol,2012,31:592-599.