沈骅睿 扶世杰 汪国友 李光胜 徐祖健 陈贵全

中药仙茅不同有效成分对骨髓间质干细胞诱导作用的比较

沈骅睿 扶世杰 汪国友 李光胜 徐祖健 陈贵全

目的 比较中药仙茅中不同有效成份对骨髓间质干细胞诱导作用的差异。方法 分别采用RT-PCR检测和倒置显微镜下观察的方法, 对使用中药仙茅多糖和仙茅黄酮诱导刺激后的骨髓间质干细胞进行检测, 观察仙茅不同有效成分对骨髓间质干细胞刺激后的变化。结果 仙茅多糖和仙茅黄酮成分均能诱导骨髓间质干细胞向神经元细胞诱导分化。结论 仙茅黄酮较仙茅多糖对骨髓间质干细胞向神经元细胞定向诱导分化的作用更强。

仙茅多糖；仙茅黄酮；骨髓间质干细胞；神经元细胞；神经胶质细胞

最近研究表明, 骨髓间质干细胞(MSCs)具有在一定条件下分化为神经细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和肌母细胞的强大潜能。因此如何诱导骨髓间质干细胞的分化并成功应用于临床成为研究热点。传统中医认为“肾主骨生髓”,基于几千年中医临床实践, 常以“温肾壮阳, 填精益髓”为治疗原则, 治疗神经系统疾病。前期研究结果证明, 仙茅作为传统温肾壮阳之要药, 其水提物具有明确促进骨髓间质干细胞向神经细胞转化的作用, 但其作用核心有效成分或单体成分是什么尚属空白。本研究选择仙茅中多糖类和黄酮类两大主体成分, 分别对成年大鼠骨髓间质干细胞体外转化为神经细胞进行研究, 并比较两类成分作用的差异性, 为进一步的有效单体成分研究及后期临床应用奠定实验基础。现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料和试剂 选用2月龄SD大鼠, 体重180～200 g, 雌雄各3只(由成都中医药大学试验动物中心提供)；仙茅多糖、仙茅黄酮提取物(由成都中医药大学药学院提供,CO60照射消毒)；胎牛血清(中美兰州民海生物公司)；胰酶(美国Amresco公司 )；改良伊格尔髙糖培养基(DMEM)(美国Gibco公司)；二甲基亚砜(DMSO)(美国Gibco公司纯度99.5%)；青霉素(成都制药一厂, 批号20040526)；链霉素(成都制药一厂, 批号20040326)；D-Hanks平衡盐溶液(美国Hyclone公司)；TriZol 试剂(美国Invitrogen公司)；PCR引物[NSE 、GFAP, 宝生物工程(大连)有限公司, 引物序列及产物大小见表1]；25 cm2塑料培养瓶、6孔板(美国Orange公司)。

表1 引物序列及产物大小

1.2 试验方法

1.2.1 大鼠MSCs的分离与培养 无菌条件下取出大鼠股骨, 剪去股骨两端, 用含10%DMEM培养液冲洗骨髓腔,反复离心洗涤后, 收集骨髓细胞悬浮液, 接种在培养瓶中,37℃、5%CO2培养。24小时和48小时后, 完全换液, 去掉未贴壁的细胞, 以后每隔3天半量换液。10～14天细胞接近融和, 0.125%胰酶消化传代。

1.2.2 定向诱导MSCs向神经元分化 细胞RT-PCR样本的制作：将第3代的骨髓细胞经记数调整细胞密度为1×105/ml,接种于6孔培养板中, 每孔加细胞悬液3 ml。在培养箱中培养24 h, 随机分组为仙茅多糖组、仙茅黄酮组、阳性对照药物组——二甲基亚砜(DMSO)和空白组, 各2孔, 先移去1.5 ml培养液, 仙茅多糖组、仙茅黄酮组、阳性对照药物组分别加入由10%DMEM配置的1%仙茅多糖提取液、0.1%仙茅黄酮提取液、4%DMSO各1.5 ml, 空白组加入10%DMEM1.5 ml。持续刺激72小时后。0.125%胰酶消化下细胞送检。

1.2.3 诱导细胞鉴定

1.2.3.1 RT-PCR检测 以神经细胞的标志性蛋白—神经元烯醇酶((NSE)和星形胶质细胞的标志性蛋白—胶质纤维酸性蛋白(GFAP)检测其mRNA的表达。

1.2.3.2 倒置显微镜下观察 分别于加药前和加药后, 在倒置显微镜下观察细胞形态的改变。

2 结果

2.1 RT-PCR检测对mRNA半定量测定结果 经测定, 4样本中均有NSE和GFAP表达。仙茅多糖组样本、仙茅黄酮组样本中NSE的mRNA表达明显高于空白样本, 仙茅黄酮组样本NSE表达接近DMSO样本, 但仙茅多糖组样本明显低于DMSO样本。仙茅多糖组样本中GFAP的mRNA表达量明显高于其余3组样本, 而仙茅黄酮组样本中GFAP的mRNA表达量明显低于其余3组样本(结果见表2、3)。

表2 NSE中mRNA表达效果比较

表3 GFAP中mRNA表达效果比较

2.2 倒置显微镜小观察结果 仙茅多糖组样本、仙茅黄酮组样本和DMSO样本在诱导48小时后, 卵圆形细胞明显减少,72小时后可见大量神经元样细胞出现, 其触突明显长出。胞体较大, 细胞核大而较为透明, 有较为明显的细胞核, 核/质较大, 有长的触突生长。而空白对照样本物变化较小。

3 讨论

通过此次试验, 我们可以得到三个结论。

3.1 虽然前期研究结果证明仙茅水提物对诱导MSCs向神经细胞分化有明确的作用, 在分子生物学水平证明了中医“肾主骨, 生髓” 理论的正确性, 但水提物中成分复杂, 不能明确其有效作用成分。本次研究进一步证明仙茅多糖、仙茅黄酮对MSCs的诱导作用存在差异, 其作用机理尚不清楚,可能与其化学结构中抗氧化基团或极性基团有关。3.2 在本试验的空白组中, 同样检测到有NSE和GFAP的mRNA表达, 这表明MSCs在体外未给药物刺激的环境下有分化为神经元样细胞的可能性, 且产生了不同于体内的分化方式, 分化出神经元细胞和神经胶质细胞。尤其仙茅多糖组样本、仙茅黄酮组样本的RT-PCR检测结果明显不同于空白对照组, 表明中药仙茅不同成分促进了对应的分化作用。

3.3 前期研究表明仙茅水提物在促进MSCs向神经元细胞转化的时候也增加了神经胶质细胞的转化。仙茅黄酮仙对骨髓间充质干细胞定向诱导作用更强, 其胶质细胞转化较少。而在中枢神经系统中少突胶质细胞可以抑制轴突再生, 对临床有积极指导意义。

通过此次试验, 我们得到一种体外获得神经细胞的培养方法, 并可为以后治疗神经损伤进行细胞移植和新药开发提供新的研究思路, 并为以后细胞移植的人体试验打下了很好的基础。

［1］ 李钢, 柯以铨, 姜晓丹, 等．食蟹猴骨髓基质干细胞体外诱导分化的试验研究．解放军医学杂志, 2002, 27(11):956-959.

［2］ 邵明, 张军, 张信英, 等.骨髓基质细胞诱导后与神经细胞的比较研究.中风与神经疾病杂志, 2003, 20(1): 8-10.

［3］ 薛庆善, 肖与平, 林娟．体外培养的原理与技术．科学出版社,2001:467-469.

Comparison of different effective ingredients of Rhizoma curculiginis in bone marrow mesenchymal stem cells indued.

SHEN Ye-rui, FU Shi-jie, WANG Guo-you, et al.
Traditional Chinese Medicine Hospital Affiliated to Luzhou medical couege.sichuan 646000, China

Objective Comparison of Chinese medicine Rhizoma curculiginis effective ingredients in different difference of bone marrow mesenchymal stem cells induced by using the method of observation; Method RT-PCR detection and inverted microscope respectively, to detect the polysaccharides and flavonoids from Curculigo orchioides stimulated using traditional Chinese medicine Rhizoma curculiginis after bone marrow mesenchymal stem cells, different observation of Curculigo orchioides the effective components of bone marrow mesenchymal stem cells after stimulation.Results Curculigo polysaccharide and Rhizoma curculiginis flavonoids could induce bone marrow mesenchymal stem cells differentiate into neurons.Conclusion Curculigo flavonoids is stronger Curculigo polysaccharide on bone marrow mesenchymal stem cells differentiation into neuron cell orientation.

Curculigo polysaccharide; Curculigo flavonoids; Bone marrow mesenchymal stem cells;Neurons; Glial cells

646000 泸州医学院附属中医医院骨科(沈骅睿扶世杰 汪国友 徐祖健 陈贵全)；广安市人民医院骨科(李光胜)

李婷 E-mail：xuebao_shr114@163.com