吴少科 曾荣 郭伟韬 钟环 谭宏昌 胡资兵 魏劲松 魏波 康毅

·论著·

VEGF-165-GMs复合自体颗粒骨修复兔陈旧性桡骨缺损的实验研究

吴少科 曾荣 郭伟韬 钟环 谭宏昌 胡资兵 魏劲松 魏波 康毅

目的 探讨VEGF-165-GMs复合自体颗粒骨修复兔陈旧性桡骨缺损的效果。方法 24只新西兰大白兔双侧桡骨均建立1.5 cm的陈旧性骨缺损实验模型, 随机分为A、B、C三组, A组植入自体颗粒骨+VEGF-165-GMs 1mg；B组植入200 mg自体颗粒骨；C组 VEGF-165-GMs 1 mg；分别于术后3、6、9周切取标本,通过X线摄片、骨密度测量、生物力学测试、组织形态学观察等手段,观察各个时期新骨形成的情况。结果 A、B组均能较好地修复陈旧性骨缺损, A组术后各时间点X线评分、骨密度测量、生物力学测试、组织形态学观察均明显优于B组。C组各时间点均无骨性愈合迹象, 9周时可见骨断端完全硬化, 髓腔封闭。结论 VEGF-165-GMs复合自体颗粒骨修复陈旧性骨缺损可以明显促进局部血运重建, 促进新生骨形成, 提高骨改建塑形的速度和质量。

血管内皮生长因子-165；自体颗粒骨 ；陈旧性桡骨缺损；骨修复

由于自体骨移植无免疫排斥反应, 组织相容性好, 生物学潜能大, 骨诱导和传导作用强, 是骨缺损治疗的“金标准”。移植骨在植入人体后能否发挥最大作用, 很大程度取决于其与宿主的血运重新建立, 移植骨的血管化是骨修复的关键环节, 因此早期建立有效血供对提高自体骨移植的疗效有着重要意义。血管内皮生长因子-165(Vasular endothelial growth factor-165,VEGF-165)通过与血管内皮细胞膜上受体结合,具有强大特异性促血管内皮细胞增生和血管生成作用, 是促进血管再生的最后通道。本实验探讨应用自体颗粒骨复合VEGF修复陈旧性骨缺损的能力, 为临床应用提供理论依据。并考虑到VEGF在局部代谢快、作用不持久的问题, 决定将VEGF-165制成缓释载体(Vasular endothelial growth factor-165-gelatinmierospheres, VEGF-165-GMs), 从而为进一步应用于骨组织工程研究提供一定依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料和仪器 新西兰大白兔24只(48条桡骨)(广东医学院实验动物中心提供), 体重2.5～2.8 kg；VEGF-165 (Pepro Tech北京博蕾德生物有限公司分装) ；双能X线密度仪( GE Lunar Prodigy 暨南大学附属医院核医学科)；生物力学试验机(MTS 858 Mini Bionix南方医科大学生物力学实验室)

1.2 VEGF-165-GMs制备 采用改良的双相乳化冷凝交联法制备明胶微球［1］, 并检测明胶微球的物理性质, 以及结合和体外缓释VEGF-165性能和规律(另文发表)。证实VEGF-165明胶缓释微球有良好的药物包封、缓释功能,VEGF-165-GMs载药率为0.2%。

1.3 VEGF-165-GM复合自体颗粒骨修复兔陈旧性桡骨缺损 参照文献报道制作兔桡骨陈旧性骨缺损模型［2］并随机分为三组：A组(9只18条前臂)：植入200 mg自体颗粒骨+VEGF-165-GMs 1mg；s B组(9只18条前臂):植入200 mg自体颗粒骨；C组(6只12条前臂):植入VEGF-165-GMs 1 mg。

手术方法：①在按前文所述建造的兔陈旧性骨缺损模型上, 于双侧桡骨原切口入将骨折端硬化部分连同纤维瘢痕组织一并切除, 将闭锁的髓腔开放, 经处理后的骨缺损段长1.5 cm ；②取一侧自体髂骨块在冰盐水中用磨钻磨成颗粒骨,离心收集；③A组植入200 mg自体颗粒骨, 1 mg VEGF-165-GMs充分混合, 形成复合物, 用内径0.6 cm、长1.5 cm管状物塑形后植于骨缺损部位；B组植入200 mg自体颗粒骨混合物；C组植入植入塑形的1mg VEGF-165-GMs；④ 逐层缝合切口。分为术后3、6、9周三个时间点观察,A、B组各时间点随机处死3只兔, C组各时间点各处死随机2只兔。

1.4 检测项目及方法 (1)X线观察 行动物双侧前肢X线正位片检查, 评估各时间点的骨形成及骨塑性构建情况。(2) 骨密度检查: 取6、9周兔桡骨利用双能X线骨密度仪小动物用骨密度测量软件检测包括骨缺损区在内桡骨中段2．0cm骨密度。(3)生物力学检查: 取6、9周标本进行桡骨三点弯曲试验。(4)病理组织学: 在普通光学显微镜下观察骨缺损修复及颗粒骨与周围骨质融合情况。

1.5 统计学分析 统计学检验实验数据用SPSS13.0 for windows统计软件分析, 计量资料用均数±标准差(x-±s)表示, P＜0.05为差异有统计学意义。若方差齐性, 采用单因素方差分析方法(one-way ANOVA)进行检验, 用LSD法进行多重比较；若方差不齐, 用Welch近似方差分析法进行检验,用Dunnett’s T3法进行多重比较, P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 X线摄片检查结果 A、B组3周时均可见植入物云雾样改变, 与宿骨间有模糊骨痂形成, 但A组模糊影较大(见图1.1)；6周时两组的骨折线均消失, 骨缺损区骨形成充满骨痂, A组髓腔部分再通, 皮质骨改建塑性, B组髓腔仍为骨痂填充, 未改建塑性(见图1.2)；9周时, A、B组均有较满意的骨修复效果, 但B组塑形效果较差, 髓腔仅部分相通(见图1.3)。C组各时间点均无骨性愈合迹象(见图1.4)。

图1.1 A组3周X光

B组3周X光

图1.2 A组6周X光

B组6周X光

图1.3 A组9周X光

B组9周X光

图1.4 C组X光

2.2 骨密度检测 术后6周及9周A组骨密度值均大于B组,差异有统计学意义(P＜0.05), 各组9周骨密度均较6周时高,差异有统计学意义(P＜0.05)(见表1)。

表1 各时间点骨密度检测(g/cm2 , x-±s)

2.3 生物力学测定 三点弯曲实验中各时间点A组桡骨最大载荷均比B组大, 差异有统计学意(P＜0.05)；随修复时间延长,骨骼质量增强, 组内比较有差异, 差异有统计学意义(P＜0.05)(见表 2)。

表2 三点弯曲实验桡骨最大载荷检测(N, x-±s)

三点弯曲桡骨位移桡度统计结果与最大载荷结果基本一致 (见表 3)。

表3 三点弯曲实验桡骨位移桡度检测(n=6, mm, x-±s)

2.4 组织学检查 3周时A组颗粒骨融合并有大片新生骨形成, 移植颗粒骨间无成纤维细胞浸润生长, 无死骨形成,颗粒骨与宿骨间融合生长, 新骨中有丰富的血管存在(图2.1)。B组颗粒骨间有较多的成纤维细胞生长填充颗粒骨间,有散在深染的死骨形成(图2.2)。6周A组颗粒骨融合成片状,内部形成松质骨样结构, 新骨中存在丰富的血管, 中板层样结构开始出现雏形(见图2.3)；B组颗粒骨间皮质骨尚未形成统一方向的骨板(见图2.4)。9周时A组皮质骨、髓腔改建塑性完成, 有正常皮质, 骨髓腔形成, 内容正常的骨髓组织(图2.5), B组髓腔亦形成, 但较为狭窄, 皮质骨未完全改建, 仍可见较多小血管穿行其中, 未形成致密的骨质(见2.6)。 C组组织学表现与陈旧性骨缺损表现相似, 6周时仍然见较多未分化间充质细胞及小血管, 成熟纤维细胞较少(见图 2.7)。

图2.1 A组3周颗粒骨与宿主骨融合(HE×40)

图2.2 B组3周散在死骨形成(HE×40)

图2.3 A组6周靠近骨膜部分改建形成与纵轴平行的骨板，骨髓样组织形成。(HE×40)

图2.5 A组9周改建基本完成(HE×40)

图2.6 B组9周皮质骨正在改建塑形(HE×40)

图2.7 未分化的间充质细胞和小血管(HE×100)

3 讨论

血管生成是骨修复的前提和基础, 没有新生血管就没有骨骼的修复, 这已成为共识。VEGF又称血管通透因子,VEGF与血管内皮细胞膜上受体结合, 具有强大特异性促血管内皮细胞增生和血管成形作用, 是促进血管再生的最后通道［3］。有学者研究发现VEGF缺乏所导致动物骨不连病理变化与临床骨不连病理改变极其相似, 从而判断VEGF缺乏是骨不连发生的原因之一［4］。VEGF在骨再生和骨修复的作用已得到了更多的证实［5］,其主要通过促进局部新生血管形成［6］及引发成骨细胞的迁移、分化、增殖［7］等作用来增强骨缺损修复能力, 是许多调节骨的生长和改建生长因子中非常重要的一种。

本次实验中实验组移植骨存活率高、无死骨形成, 早期大量的新生软骨形成, 颗粒骨间融合, 移植物与宿主骨整合等骨修复表现比对照组更优,其原因可能是缓释的VEGF-165促进新生血管形成, 改善局部血运, 使移植骨保留其细胞活性直接促进骨修复, 同时带入间充质骨细胞向成骨细胞方向分化, 形成新骨, 优于单纯移植颗粒骨经历的“爬行替代”过程。VEGF-165还可以通过血管内皮细胞来间接参与骨修复过程, Palazzini S等［8］发现新生的血管内皮细胞可以促进骨髓干细胞向成骨源性细胞方向分化, 在外源性VEGF-165作用下实验组新生血管形成早、多, 进而观察到后续骨痂形成较为规整, 新骨形成量多, 板层骨形成较早, 骨改建塑形所需的时间短, 其修复效果更佳、更快, 在后期X线评分及组织学检查结果均优于对照组, 从侧面证实了Palazzini S的观点。

结果表明VEGF-165-GMs复合自体颗粒骨能增强颗粒骨血运重建, 提高移植骨的存活, 诱导新骨形成, 加快骨骼改建塑形, 从而促进骨修复。但具体的作用机制尚不明确,还需进一步的实验研究探讨, 所涉及的细胞信号途径等一系列问题也有待后续的实验研究加以明确。

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Experiment on repairing obsolete radial defects in rabbits with the composite of VEGF-165-GMs and autogenous morselized bone

WU Shaoa-ke, ZENG Rong,GUO Wei-tao, et al.
Department of Orthopedics ,Affiliated Hospital of Guangdong Medical College,Zhangjiang 524001,China

Objective To explore the effect about composite of VEGF-165-GMs and autogenous morselized bone on the repairing obsolete radial defects in rabbits.Methods Make obsolete radial defect model on 24 rabbits’double radial,then randomly divided into A, B, C groups.A group treated with the compound of the VEGF-165-GMs and autogenous morselized bone on obsolete radial defects, B group treated with autogenous morselized bone only, C group treated with VEGF-165-GMs ; animals were put to death at different time points(3,6,9 week) to get the model, through X-ray imaging, bone density measure,biomechanics test, histology compare to understand the growth condition of new bone at different time points.Results A,B groups both active repair obsolete radial defects in rabbits.But A group reflected better in X-ray imaging, bone density measure ,biomechanics test, histology compare.C group has no synostosis at any time.In 9 week the broken ends of fractured bone to become complete sclerosis, and the canals of de Candolle were blockaged.Conclusion The composite of VEGF-165-GMs and autogenous morselized bone can distinguished enhance local revascularization, and promote neoplastic bone formation, improve the speed and quality of bone remodeling and bone moulding.

Vasular endothelial growth factor-165; Autogenous morselized bone ; Obsolete radial defects ;bone repair.

广东省科技计划项目(项目编号：2010B031600288)；湛江科技攻关计划项目(项目编号：2012C3102030)

524023 湛江, 广东医学院附属医院骨科

E-mail：wushaoke@yahoo.cn